单细胞测序揭示骨髓病变中的衰老免疫景观诱导骨关节炎软骨损伤
文章信息
- 发表杂志 Bone Research
- 中文标题 单细胞测序揭示骨髓病变中的衰老免疫景观诱导骨关节炎软骨损伤
- 英文标题 Single-cell sequencing reveals a senescent immune landscape in bone marrow lesions inducing articular cartilage damage in osteoarthritis
- 影响因子 ~15
- 发表日期 2025年11月21日
- DOI 10.1038/s41413-025-00467-4
小编有话说：很多客户会问，这个分析有什么意义？本篇文章的分析，例如细胞通讯，都是常见的结果和图，重点是在于结合疾病背景对结果的解释！那些显著的通路自然有他的意义。这也是写文章讨论的关键！同一个分析不同的人写，可能会大幅影响文章的影响因子。
研究概述
骨关节炎（OA）是一种年龄相关的退行性疾病，影响膝关节的所有组织。骨髓病变（BML）是OA的早期标志，与软骨损伤恶化密切相关。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了来自4名接受单髁膝关节置换术患者的骨髓样本（非BML和BML区域）以及关节软骨样本（完整和受损区域），系统探索了BML的免疫景观和BML-软骨相互作用机制。
核心发现
- 非经典单核细胞（Non-classical monocytes）表现出高炎症、高OA基因特征和高衰老评分，是促进OA进展的关键细胞群
- 受损软骨中前纤维软骨细胞（PreFC）显著耗竭
- 非经典单核细胞通过TNF信号通路与软骨细胞（特别是PreFC）相互作用，诱导软骨损伤
- TCF7L2被鉴定为单核细胞和软骨细胞衰老的共同转录调控因子，促进衰老相关分泌表型（SASP）的发展
Figure 1：BML中的免疫细胞景观分析
研究目标
探索BML区域骨髓（BM）的免疫细胞组成****和炎症特征，揭示BML如何促进OA进展。
方法与目的
| 分析类型 | 具体方法 | 目的 |
|---|---|---|
| 单细胞测序 | 对4例患者的非BML和BML区域BM进行scRNA-seq（共43,432个细胞） | 识别细胞亚群并比较两组差异 |
| 细胞注释 | 使用CellTypist自动注释+文献验证 | 鉴定24种细胞亚群（包括6种髓系细胞、8种T细胞、4种B细胞等） |
| 功能评分 | 炎症基因集和OA基因集评分 | 评估各细胞群的促炎和促OA能力 |
实验设计与结果
为什么进行BML与非BML的比较？ BML是OA早期标志，MRI显示为亚软骨骨高信号区域，与软骨体积减少密切相关。通过比较BML和非BML区域，可以揭示病变组织的特异性免疫改变。
关键发现
- 细胞组成变化（Fig. 1a-c）：
- BML组中经典单核细胞比例下降
- 非经典单核细胞、CD16+ NK细胞、Tcm/Naive helper T细胞比例上升（虽无统计学差异，但趋势明显）
- 炎症和OA评分（Fig. 1d-e）：
- 巨噬细胞、非经典单核细胞、经典单核细胞具有最高的炎症评分和OA评分
- BML组的单核细胞炎症评分和OA评分显著高于非BML组
- 生物学通路富集：
- BML中经典单核细胞上调IL-17信号通路、TNF信号通路、细胞衰老通路
- 非经典单核细胞同样上调炎症通路
- 细胞间通讯（Fig. S5a）：
- 经典单核细胞是BM中主要的信号接收者和发送者
- 主要信号包括ANNEXIN、MIF、GALECTIN、CCL等免疫相关信号
逻辑解读
→ BML中单核细胞向促炎状态转变 → 非经典单核细胞表现出最高的炎症和OA特征 → 这些细胞可能是BML促进OA进展的关键驱动因素
Figure 2：软骨细胞的单细胞景观分析
研究目标
解析完整软骨和受损软骨的细胞组成变化，识别与OA进展相关的关键软骨细胞亚群。
方法与目的
| 分析类型 | 具体方法 | 目的 |
|---|---|---|
| 单细胞测序 | 对4例患者的完整和受损软骨进行scRNA-seq（共54,412个细胞） | 识别软骨细胞亚群 |
| 细胞鉴定 | 基于文献标记基因注释16个细胞群 | 区分不同功能状态的软骨细胞 |
| 拟时序分析 | Monocle2和RNA velocity分析 | 揭示细胞分化轨迹 |
| 免疫组化验证 | IHC检测PreFC、FC-2、OssifyC标记蛋白 | 验证细胞亚群比例变化 |
实验设计与结果
为什么重点关注PreFC？ 最近研究发现PreFC以THBS1和PIEZO2为标记，能够预防软骨退化，OA患者PreFC减少与软骨损伤加重相关。
关键发现
- 细胞组成变化（Fig. 2a-c）：
- PreFC在受损软骨中显著减少（*P < 0.05）
- FC-1、pre-HTC、PathC、OssifyC、内皮细胞、巨噬细胞比例上升
- PreFC的功能特征（Fig. 2d）：
- 高表达THBS1、PIEZO2（PreFC标记基因）
- 参与细胞外基质组织、软骨发育、软骨细胞分化等维持软骨稳态的生物学过程
- 同时参与OA相关过程（血管生成、骨化、机械刺激检测）
- 分化轨迹分析（Fig. 2e-f）：
- Monocle分析显示：PreFC沿轨迹分布，OssifyC位于终点
- RNA velocity分析揭示：PreFC可分化为FC-1、FC-2、PathC
- 这解释了为什么受损软骨中PreFC减少而FC增加
- 免疫组化验证（Fig. S9）：
- 完整软骨的表层区（SZ）和中层区（MZ）中THBS1+和PIEZO2+细胞（PreFC）显著多于受损软骨
- 受损软骨中Lubricin+细胞（FC-2）在SZ显著增多
- OPN+细胞（OssifyC）在受损软骨的SZ和MZ显著增多
- 细胞间通讯（Fig. S5b）：
- PreFC是软骨内部信号接收和发送的核心
- 发送信号：ANGPTL、MIF、FGF、GRN、PDGF、BMP（促进软骨修复和稳态）
- 接收信号：VISFATIN、TGFb、MK、BMP、GRN
逻辑解读
→ PreFC维持软骨稳态 → OA进程中PreFC向FC-1/FC-2/PathC分化 → PreFC耗竭导致软骨保护功能丧失 → 受损软骨中病理性软骨细胞（FC、PathC、OssifyC）增多
Figure 3：BML与软骨之间的细胞通讯网络
研究目标
揭示BML如何通过细胞间信号传递影响软骨损伤，识别关键的通讯路径。
方法与目的
| 分析类型 | 具体方法 | 目的 |
|---|---|---|
| CCI分析 | 使用CellChat分析BM-软骨间的配体-受体相互作用 | 识别关键信号通路 |
| 信号强度评估 | 计算21条BM→软骨信号和25条软骨→BM信号 | 量化信号传递强度 |
| 关键通路验证 | 重点分析TNF、VISFATIN、CSF、SEMA3等信号 | 揭示BML诱导软骨损伤的机制 |
实验设计与结果
为什么分析BM-软骨通讯？ 证据表明软骨和软骨下骨之间存在直接的分子通讯，血管通道连接骨髓、关节腔和滑膜，促进信号和细胞浸润。因此BML微环境改变可能通过这种通讯导致软骨退化。
关键发现
- BM→软骨信号（Fig. 3a）：
- 高强度信号：MIF（促炎）、GALECTIN（软骨稳态）、VISFATIN（软骨降解）、TGFb（软骨稳态）
- PreFC是主要的信号接收者，接收VISFATIN、TGFb、MK、BMP、GRN信号
- 软骨→BM信号（Fig. 3b）：
- 高强度信号：MIF、ANNEXIN、ANGPTL（促炎）、CXCL、CCL（募集单核细胞）
- 经典单核细胞是主要的信号接收者和发送者
- TNF信号通路（Fig. 3d）：
- 非经典单核细胞是唯一向软骨细胞发送TNF信号的细胞群
- PreFC和EC是TNF信号的主要接收者
- TNF-TNFRSF1A配体-受体对介导此通讯
- VISFATIN信号（Fig. 3c）：
- 经典单核细胞通过NAMPT-(ITGA5+ITGB1)向FC-2、PathC、EC等发送VISFATIN信号
- VISFATIN促进软骨基质降解
- 骨重塑相关信号（Fig. 3e-f）：
- PreFC向非经典单核细胞发送SEMA3信号（抑制破骨细胞分化）
- FC-2向非经典单核细胞发送CSF信号（促进破骨细胞形成）
- 提示非经典单核细胞可能是软骨下骨破骨细胞形成的主要细胞群
逻辑解读
→ BML中的非经典单核细胞发送TNF信号 → PreFC接收TNF信号后向FC-2/PathC分化 → PreFC耗竭，软骨保护功能丧失 → FC-2反过来促进非经典单核细胞的破骨细胞分化 → 形成BML-软骨损伤的恶性循环
Figure 4：衰老评估与转录因子TCF7L2的鉴定
研究目标
评估BML和受损软骨的衰老水平，识别调控衰老的关键转录因子。
方法与目的
| 分析类型 | 具体方法 | 目的 |
|---|---|---|
| 衰老评分 | 使用SenMayo基因集进行GSVA评分 | 量化各样本和细胞群的衰老程度 |
| 转录调控网络 | pySCENIC分析识别regulons | 鉴定细胞特异性转录因子 |
| TCF7L2靶基因预测 | 整合5个数据库预测TCF7L2靶基因 | 揭示TCF7L2调控的信号通路 |
实验设计与结果
为什么关注衰老？ 衰老细胞通过分泌SASP（衰老相关分泌表型）影响周围细胞，导致炎症和组织退化。非经典单核细胞的促炎CCIs类似SASP表型，提示衰老在OA中的关键作用。
关键发现
- 样本水平衰老评分（Fig. 4a-b）：
- BML组骨髓和受损软骨的衰老评分显著高于对照组（****P < 0.0001）
- 细胞水平衰老评分（Fig. 4c-d）：
- BM中：非经典单核细胞和经典单核细胞具有高衰老评分
- 非经典单核细胞的衰老水平显著高于经典单核细胞
- 软骨中：FC-2具有最高衰老评分，高于PreFC
- 免疫荧光验证：非经典单核细胞（CX3CR1+）的p21水平高于经典单核细胞（CCR2a+）；FC-2（Lubricin+）的p21水平高于PreFC（THBS1+）
- 转录因子分析（Fig. 4e-f）：
- pySCENIC识别出5个非经典单核细胞特异性转录因子：TCF7L2、PLAGL2、MEF2A、ZBTB7A、POU2F2
- 其中TCF7L2、MEF2A、ZBTB7A在软骨细胞中也有调控作用
- TCF7L2在PreFC和FC-2中具有高AUCell评分
- 由于FC-2衰老水平高于PreFC，且PreFC可分化为FC-2，推测TCF7L2促进单核细胞和软骨细胞衰老
- TCF7L2靶基因和通路（Fig. 4g-h）：
Wnt信号通路（最显著）
细胞衰老、TNF信号通路、p53信号通路
整合5个数据库，预测得到782个TCF7L2靶基因
KEGG富集分析显示：
提示TCF7L2激活导致衰老和炎症反应
逻辑解读
→ BML和受损软骨呈现高衰老状态 → 非经典单核细胞和FC-2是最衰老的细胞群 → TCF7L2是单核细胞和软骨细胞共同的衰老调控因子 → TCF7L2激活Wnt、细胞衰老、TNF、p53通路
Figure 5：TCF7L2调控衰老的体外验证
研究目标
验证TCF7L2在单核细胞和软骨细胞衰老中的调控作用，确认其促进SASP的功能。
实验验证方案
| 实验类型 | 具体方法 | 目的 |
|---|---|---|
| 衰老诱导 | DOX处理C28/I2（软骨细胞）和THP-1**（单核细胞） | 建立体外衰老模型 |
| IHC验证 | 检测受损和完整软骨中TCF7L2表达 | 验证临床样本中TCF7L2上调 |
| Transwell共培养 | 衰老单核细胞与软骨细胞共培养 | 验证衰老单核细胞诱导软骨细胞衰老 |
| 过表达/敲低 | TCF7L2过表达和shRNA敲低 | 验证TCF7L2对衰老和SASP的调控 |
实验设计与结果
为什么选择DOX诱导衰老？ 阿霉素（DOX）是公认的衰老诱导剂，可在单核细胞和软骨细胞中诱导衰老表型，用于模拟体内衰老状态。
关键发现
- DOX诱导衰老验证（Fig. 5a-c）：
- DOX处理后，THP-1和C28/I2细胞的TCF7L2、CDKN1A（p21）、SASP基因（HMGB1、TGFB1、CCL4、FGF2、IL7）表达显著上调
- THP-1中TNF表达上调
- Western blot证实p21蛋白水平升高
- 临床样本验证（Fig. 5d-e）：
- IHC显示：受损软骨的表层区（SZ）和中层区（MZ）TCF7L2+细胞显著多于完整软骨
- IF显示：TCF7L2在受损软骨中高表达
- 衰老单核细胞诱导软骨细胞衰老（Fig. 5f-h）：
- Transwell实验：DOX处理的THP-1与C28/I2共培养
- 结果：C28/I2中CDKN1A、TCF7L2、SASP基因显著上调
- 人原代CD14+单核细胞和人原代软骨细胞共培养实验得到相同结果
- 证明：衰老单核细胞通过分泌SASP因子诱导软骨细胞衰老
- TCF7L2过表达实验（Fig. 5i, k）：
CDKN1A、SASP基因（HMGB1、TGFB1、CCL4、FGF2、IL7）上调
THP-1中TNF上调
p21蛋白水平升高
TCF7L2过表达后，THP-1和C28/I2中：
- TCF7L2敲低实验（Fig. 5j, l）：
CDKN1A、SASP基因（HMGB1、TGFB1、IL7）表达下调
THP-1中TNF表达下调
p21蛋白水平降低
shRNA敲低TCF7L2后，在DOX诱导的衰老细胞中：
证明：TCF7L2是衰老和SASP的关键调控因子
逻辑解读
→ TCF7L2在衰老诱导中表达上调 → TCF7L2过表达促进p21表达和SASP因子分泌 → 衰老单核细胞通过SASP诱导软骨细胞衰老 → 敲低TCF7L2可部分逆转衰老表型 → TCF7L2是治疗OA的潜在靶点
研究总结
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本研究通过单细胞RNA测序系统解析了骨髓病变（BML）和软骨损伤在骨关节炎中的病理机制，揭示了衰老免疫景观在OA进展中的核心作用。
核心创新点
- 首次系统揭示BML的单细胞免疫景观：
- 鉴定出非经典单核细胞作为BML中最关键的促炎和促OA细胞群
- 发现其具有高炎症、高OA基因特征和高衰老评分
- 阐明BML-软骨通讯机制：
- 通过细胞间相互作用CCI）分析，发现*非经典单核细胞通过TNF信号通路诱导软骨细胞（特别是PreFC）损伤
- PreFC耗竭是受损软骨的重要病理特征
- 识别TCF7L2为衰老调控的共同转录因子：
- TCF7L2在单核细胞和软骨细胞中均促进衰老
- 激活Wnt、细胞衰老、TNF、p53信号通路
- 促进SASP（衰老相关分泌表型）的发展
- 建立"衰老-炎症-软骨损伤"的病理链条：
- BML中衰老的非经典单核细胞 → 分泌TNF等SASP因子 → 诱导PreFC衰老和分化 → PreFC耗竭 → 软骨保护功能丧失 → OA进展
临床意义
- 早期诊断标志物 TCF7L2、非经典单核细胞衰老标志物可作为OA早期诊断的生物标志物
- 治疗靶点
- 清除衰老细胞（senolytics）
- 抑制TCF7L2或其下游Wnt/TNF通路
- 保护PreFC防止其向病理性软骨细胞分化
- 治疗策略 针对BML的关节内或骨内治疗可能阻断BML-软骨通讯，延缓OA进展
研究局限与展望
- 样本量较小（n=4），未来需扩大队列验证
- 缺乏空间转录组数据，无法精确定位衰老细胞的空间分布和SASP的局部效应
- 体内验证有限，需在动物模型中验证靶向TCF7L2的治疗效果
本研究为理解OA发病机制提供了单细胞水平的系统性视角，揭示了衰老、炎症和骨-软骨通讯在OA中的整合作用，为开发精准治疗策略奠定了理论基础。
