实验设计其实比实验本身更重要！！好的实验设计可以事半功倍，节省时间节省时间！！尤其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。
一、 对于一个real-time qPCR而言，首先就是实验材料的处理和料；然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的50%；进行实验和数据分析（这一部分单独说明）。
实验材料的处理和准备：
在材料收集过程中，尽量避免RNA的降解（尤其对于绝对定量的样品）。
引物设计
一般real-time PCR 引物的设计遵循下面一些原则：
扩增产物长度在80-150bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在15～30碱基之间。 G+C含量在40%～60%之间。 碱基要随机分布。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物5’端可以修饰。
引物3’端不可修饰。
引物3’端要避开密码子的第3位。
3.Taqman® 探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。遵循下面以下原则：
尽量靠在上游引物；
长度30－45bp，Tm比引物高至少 5℃；
5’端不要是G，G会有淬灭作用，影响定量
二、Real-time qPCR操作过程操作过程
RNA提取和反转录：全程佩戴一次性手套。
Mix配制：一般来讲，进行real-time
qPCR
MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1µl或者1µl的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。由于real-time
qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。
3.仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。
A．首先是实验目的选择：定量还是其他。
实验方法的选择: 如，比较Ct的SYBR Green方法，Fast程序，以cDNA为模板进行。
目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。
样品的设置: 包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置
对照组和内参基因的设置: 这个是为后面的定量做准备的
反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。循环反应是9X℃ X秒，X℃ X秒的X个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。
反应体系的设置：
A-G这五个步骤这五个步骤简单设置好，可以保存，修改修改反应程序或者立刻进行反应。
4.设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN ！
三、Real-time qPCR数据分析
基线（baseline）
通常是3－15个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
2.阈值（threshold)
自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
3.Ct值 :与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。
4.Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光
发射强度的比值。
5.Rn△：Rn△是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn = Rn–基线）。
