整合应激反应
1. Ischemia/Reperfusion Is Associated With Decreased Protein Synthesis
为了探究I/R下心肌的全局变化，作者使用H9C2体外构建了I/R模型，对蛋白质进行了质谱检测(a)。富集结果显示翻译是最显著的通路(b)。接着作者使用wb进行了验证。在使用H9C2进行缺血处理4h，随后灌注不同时间。在细胞收取15分钟前，使用了puromycin处理，以在不影响细胞存活的情况下标记新合成的蛋白。对puro标记蛋白的WB结果验证了I/R引起H9C2蛋白合成下降(c, d)。在小鼠胚胎成纤维细胞上也发现了类似的结果(e, f)。小鼠模型上也得到了一致的结果(g, h)。
2. PERK/eIF2α Signaling Is Activated by I/R
蛋白翻译过程受到多个层面的调控。而翻译起始时最重要的步骤。ISR在被多种刺激激活后，可以抑制翻译起始从而重塑细胞稳态。其中关键的调控枢纽是eIF2a，其在丝氨酸51位的磷酸化可以引起eIF2B的抑制，并抑制翻译起始。
为了探究ISR是否参与I/R中的蛋白翻译抑制，作者首先检测了eIF2a的磷酸化。结果显示eIF2a的磷酸化存在快速的显著增加(a, b)。体内试验也得到了一致的结果(c, d)。
由于eIF2a有四个上游激酶：HRI, PKR, PERK和GCN2，作者首先探究了是哪种激酶参与了eIF2a的磷酸化，发现I/R处理的H9C2种只有PERK显著磷酸化(E)，动物样本也得到同样的结果(f)。对时间点的检测发现p-PERK存在快速活化(g, h)。
Collectively, these data suggest that the PERK/eIF2α axis of the ISR is activated by I/R to inhibit protein translation.
3. PERK Protects the Heart From Reperfusion Injury In Vivo
接着作者构建了心肌特异性PERK敲除鼠，构建IR模型后发现敲除鼠心脏梗死面积增大，心功能恶化。而PERK敲入鼠则对IR起到保护作用。
These findings together suggest that PERK is necessary and sufficient to confer cardioprotection against reperfusion injury in vivo.
4. PERK/eIF2α Signaling Protects Cardiomyocytes From Reperfusion Injury In Vitro
为了探究PERK/eIF2α通路的作用是否是cardiomyocyte-autonomous，作者首先在体外沉默了PERK (a)，发现细胞存活下降，死亡增加(b)。使用PERK抑制剂抑制PERK磷酸化和eIF2a活化也引起了心肌活率下降(c, d)。在成纤维细胞中也存在类似的现象(e)。同样的，PERK过表达引起了H9C2, 原代心肌和成纤维的死亡下降(f, g)。突变 eIF2a磷酸化位点丝氨酸51位可以阻断PERK激活对细胞存活率的影响(h, i)。
Taken together, these data support that the PERK/eIF2α axis of the ISR protects cells from reperfusion injury in vitro.
5. Activation of PERK/eIF2α Signaling Suppresses Protein Synthesis
接着作者探究了抑制蛋白合成是否是PERK介导的心脏保护作用的潜在机制。因此作者在PERK double transgenic mice，使用了dimer去激活PERK和其下有靶点eIF2a，发现激活PERK可以引起体内蛋白合成的下降(a)。H9C2细胞中PERK的激活可以引起蛋白翻译抑制(b)。在心脏过表达PERK进一步降低了IR小鼠心脏的蛋白合成，而PERK cKO阻断了灌注引起的蛋白合成下降(c)。接着作者在H9C2中激活了PERK/eIF2a信号通路，并使用ISRIB抑制了eIF2a的磷酸化，发现ISRIB起到了保护作用(d, e)。
6. PERK Suppresses Protein Synthesis of Mitochondrial Complexes
由于ISR的激活对蛋白合成具有全局抑制作用，作者想要探究IR中心肌ISR的激活是否存在选择性靶点。RNAseq结果显示过表达PERK引起了线粒体通路的显著富集，提示其可能参与线粒体蛋白的调控(a)。接着作者验证了PERK对线粒体蛋白复合体表达的影响，发现敲低PERK促进了NDUFAF2的表达(b, c)，而过表达PERK后NDUFAF2的表达受到最显著的抑制(d, e)。沉默PERK引起了ROS的增加(g, h)，而过表达PERK降低了ROS (i, j)。使用 Mito-TEMPO, a mitochondrial superoxide scavenger, 显著减轻了PERK 沉默引起的细胞死亡(k)。In aggregate, these findings strongly suggest that the PERK/eIF2α axis of the ISR selectively targets mitochondrial complexes to decelerate electron transfer, reduce ROS production, and protect cardiomyocytes from reperfusion damage.
7. ISR Activation Protects the Heart From Reperfusion Injury In Vivo
最后作者探究了eIF2a抑制剂Salubrinal的治疗效果，发现其可以改善I/R。
