㈠细菌生长曲线测定
一、目的要求
1.了解细菌生长曲线特点及测定原理。
2.学习用比浊法测定细菌的生长曲线。
二、原理
将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。
生长曲线的制作: 接种→适温培养→定时取样测定生长量
将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。
比浊法测定:
由于细菌悬液的浓度与光密度(OD值)成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一-定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。
三、仪器材料
1.仪器: 721分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、pH计
2.菌种: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌
3.试剂: 蛋白胨10g,牛肉膏3g，氯化钠、琼脂、1mol/L 的NaOH和HCI溶液
4.其他: 试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、药匙、称量纸、pH试纸、试管塞、包扎纸等
四、操作步骤
流程:种子液→标记接种→培养→测定
(一)生长曲线的测定
1. 配制培养基与接种子液(周一)
牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、pH7.2。
每组200ml、100ml三角瓶2个,各装50m培养基(1个接种子液、1个当分光光度计对照)，其余100ml装试管(分9支试管每支9ml)。
接种子液:取各菌斜面菌种支，以无菌操作挑取2-3环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静止培养18h作种子培养液。
2.标记编号(周二)
取盛有9 mL无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管9支,分别编号为:
0h 8点半\2h 10点半\4h 12点半\8h 16点半\10h 1 8点半\12h 20点半\24h周3三早8点半\48h周四早8半。
3. 接种培养与生物量测定(周二至周三、周四早晨)
用1mL移液枪准确吸取1ml种子液加入已编号的9支试管中，于37°C下静置培养。
然后分别按对应时间将试管取出，以空白培养基为对照，测定不同培养时间样品的OD600值。
4. 结果记录
1.将测定的OD值填入下表。
时间／h
0
2
4
6
8
20
24
48
OD600
0.027
0.144
0.232
0.248
0.254
0.261
0.245
0.398
2.以上述表格中的时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制细菌的生长曲线。
(二)环境因素对微生物生长的影响
1.配培养基: 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠。每组配250ml, 分装后余下至少50m培养基当对照。(周三)
(1) pH对微生物生长的影响
配制pH 4.0\4.8\)5.6\6.417.218.0\8.8\9.6共8支(9ml) 培养基(接种量1ml,温度37"C)共72ml
(2)温度对微生物生长的影响
配制不同培养温度的47. 37、27. 17C共4支(9ml) 培养基(接种量1ml、pH7.2) 、共36ml
(3)氧气对微生物生长的影响
配制不同装液量1.8 (接种量0.2) 、3.6 (0.4)、5.4 (0.6)、7.2(0.8)、9 (1) 、10.8(1.2)、 12.6(1 .4)共7支培养基(接种量10%,培养温度37°C pH 7.2)。共50ml。
9+36+50+50 (对照) =155ml 调7.2，其他约100ml调7*9ml=63ml pH培养基，从中间往两侧调。
2.标记试管:进行接种pH、温度、装液量的实验。
3.测生物量:培养约24h后测定生物量0D600。
4.结果记录、绘制图表:
PH
4.0
4.8
5.6
6.4
7.2
8
8.8
9.6
OD600
0.397
0.142
0.400
0.424
0.321
0.335
0.244
0.425
温度／℃
17
27
37
47
OD600
0.210
0.303
0.297
0.066
装液量／ml
1.8
3.6
5.4
7.2
9
10.8
12.6
OD600
0.713
0.462
0.416
0.324
0.362
0.300
0.277
