细胞在组织中的位置信息，对于理解疾病和癌症发生机制，是非常重要的。空间转录组技术是一项新的技术突破，它可以揭示组织中的基因活跃度，并同时展示出这些活跃信号的精确区域位置。2016年，各种空间转录组技术开始发布，此后已成功应用于发育生物学，肿瘤学，神经科学以及神经疾病领域。

10x Visium 空间转录组产品，在组织原位以超高分辨率研究基因表达特征和空间分布。此商业化产品，把空间位置信息和转录组分析结合，展示组织中不同位置的基因活跃信息，对于癌症、免疫、神经、发育等领域，有着令人期待的应用前景。

目前已经正式商业化的空间基因表达产品包括：RNAscope、GEOMx-DSP、ST(spatialtranscriptomics，2018年被 10x Genomics 收购)和 10x Visium 等。

10x Visium 技术是目前发展最成熟的空间转录组技术之一，与其他技术相比具有以下几大优势：

• 获得无偏差的高通量基因表达

• 空间分辨率较高（55 μm）

• 检测面积大（42.5 mm2）

• 检测效率（灵敏度）高

• 完整、简易的操作流程

• 可拓展至膜蛋白、抗原、免疫图谱检测等

技术原理：

10x Visium 空间转录组的技术工作原理是基于一种特殊化设计的载玻片完成样本捕获，从而空间位置标记的探针与细胞释放的 RNA 杂交，载玻片上原位完成反转录合成 cDNA，收集 cDNA，最后进行测序文库构建。

• 一个载玻片可容纳4个切片(捕获区域)，制备4个文库；

• 每个6.5mm x 6.5mm 捕获区域, 有5000个 barcode 标记的 ST 位点；

• 每个ST位点有百万个 UMI 探针；

• 每个位点直径55μm，点与点之间相距100μm;

• 每个位点覆盖1-10个细胞，检测数千个基因;

• 通过 Poly T 捕获带有 PolyA 的 RNA，利用独特的空间 barcode 进行空间位置标记

技术路线：

10x Visium 的实验流程从新鲜组织处理开始，新鲜组织先进行速冻包埋和冷冻切片，将切片贴在基因表达芯片的捕获区域，进行 H&E 染色拍照，记录组织切片的组织学形态信息。然后进行组织透化，使细胞中的 RNA 释放出来并被芯片上的 poly T 探针捕获。逆转录反应合成 cDNA 并引入 spatial barcode 和 UMI。合成二链 cDNA 之后转移到 EP 管中进行文库构建，最后进行文库测序和分析。

在进行正式的基因表达文库实验之前，推荐利用 10x 官方提供的组织优化试剂盒（Visium Spatial Tissue Optimization Kit）进行样本通透化时间的测试以确定最佳透化时间。组织优化实验流程展示如下：

组织优化的玻片没有 spatial barcode，最终得到的结果是 cDNA 荧光足迹图片。我们根据 cDNA 荧光足迹图片选择最佳的透化时间。

正式的基因表达文库实验流程如下：

10x空间转录组文库，采用 Illumina Hiseq PE150 或 NovaSeq PE150 测序策略，推荐每个位点（spot）测50,000-100,000 reads，即每个样本（5000个spots）测75-100G 数据量。测序深度与样本在载玻片上捕获区域的覆盖面积和样本类型及复杂度有关，适当加大测序数据量可提高基因的检出率。

信息分析流程：

获得原始测序序列（Sequenced Reads）后，通过如下流程进行生物信息分析。使用 10x 官方发布软件 Space Ranger 将基因表达信息与组织切片的位置信息结合起来，直观地展示细胞分群和细胞亚群在组织切片上的空间分布以及差异基因的空间分布。后续对这些差异基因进行功能富集，从而鉴定亚群的功能特征。除了 Space Ranger 的分析结果，同时，我们也提供了第三方软件 Seurat 的基本分析结果。另外，我们还可以根据客户需求提供细胞定义、SNV 分析、CNV 分析、配受体分析等。

空间转录组结果示例：

下面我们将展示两个小鼠大脑组织切片的空间转录组数据的部分分析结果。

| Space Ranger 比对与定量

我们使用 Space Ranger 软件进行组织检测，数据比对和定量分析，下图是其中一个样本的组织检测、UMI 数量和基因数目在空间上的分布，从图中可以看出该切片的组织覆盖度为67%。

组织检测、UMI 数量、Gene 数目在空间上的分布 

| Space Ranger 聚类分析

我们提供了 SpaceRanger 降维和聚类分析的结果，下图展示的是 graph-based 算法的分类结果。

Graph-based 分类结果展示：cluster 空间分布、t-SNE二维空间展示、UMAP 二维空间展示

| Seurat 聚类分析

对于空间转录组的数据，我们使用 SCT 算法进行标准化处理，然后进行基于 Seurat 软件包的降维和聚类分析。

聚类分析展示：cluster 空间分布、t-SNE 分布、UMAP 分布

| 多样本整合聚类分析

我们结合 Seurat 软件包和 Harmony 算法进行多样本整合、降维和聚类分析。Harmony 整合了多个样本的低维映射（例如 PCA）数据，使用模糊聚类（fuzzy clustering）的算法进行分类，同时根据 cluster 的总体效应和样本特异效应，对每个 barcode 的分类进行校正。不断重复整个过程，直到 barcode 分类收敛为止。下面是两个样本整合聚类的结果：

各样本中 cluster 相对占比的柱状图

整合聚类 cluster 水平和样本水平的 t-SNE 二维空间展示

 | marker基因展示

我们根据聚类结果，对每个 cluster 进行差异分析，筛选出每个 cluster 的 marker 基因；也可以根据细胞定义的结果确定每个 cluster 的 marker 基因。下图是其中一个 cluster 的 marker 基因的展示。

marker 基因表达的小提琴图、空间分布图、t-SNE 二维空间和 UMAP 二维空间展示图

| 空间特异表达基因

Seurat 软件提供了一种不基于聚类结果的空间特异性表达基因筛选的方法。这种方法（markvariogram）可以度量基因表达与其所在空间位置的依赖关系，通过设置一定的阈值，可以检测出局部空间特异表达的基因。下图展示了前3个空间特异表达基因。

空间特异表达基因展示