1.下载sra序列
SRA（Sequence ReadArchive）数据库是用于存储二代测序的原始数据，包括454，Illumina，SOLiD，IonTorrent，Helicos和CompleteGenomics。除了原始序列数据外，SRA现在也存在raw reads在参考基因的比对信息。
（1）进入在NCBI数据库里面的SRA数据库
我搜索的是基因组很小的肠脑炎微孢子虫（Microsporidia）
在Send to中点击Run Selector，然后点击Go。
会出现如下界面：
我随意找了两个比较小的测序数据文件：
SRR065292
SRR070508
首先需要在linux下载SRAtoolkit，然后才能下载SRA数据。
然后再执行命令将SRA数据下载下来：
prefetch SRR065292
prefetch SRR070508
但是会报错：
我查询了很久，都没有找到它的解决办法。
那么我尝试用另一种办法将这两个SRA数据下载下来。
进入NCBI网站，点击Send To，然后再点击File->Runinfo->Create File。然后会生成一个csv文件，我将它用excel打开并找到我需要的那两个数据。
我们在download_path中找到对应的下载路径，然后进行下载。
下载得到这样两个文件：
SRR065292.lite.1
SRR070508.lite.1
但是我不知道怎么用，而且还是需要用fastq-dump命令。
后来我想是否要下载最新版的SRA toolkit，原先的版本是sratoolkit.2.9.2-ubuntu64。
于是我下载了最新的SRA toolkit版本（sratoolkit.3.0.0-ubuntu64），下载的方法如下：
官网：https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit
##wget的-P参数，设置下载文件保存的路径是~/Biosofts/（路径可以更换为自己要下载的路径）
1.wget -P ~/Biosofts/ https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/3.0.0/sratoolkit.3.0.0-ubuntu64.tar.gz
2.cd Biosofts/
3.tar zvxf sratoolkit.3.0.0-ubuntu64.tar.gz
4.cd ~/Biosofts/sratoolkit.3.0.0-ubuntu64##注意：这里不进入bin目录下
5../bin/vdb-config --interactive
6../bin/fastq-dump##检验是否安装成功
7.vi .bashrc
8.export PATH=~/Biosofts/sratoolkit.3.0.0-ubuntu64/bin:$PATH##末端添加
9.source ~/.bashrc
10.fastq-dump或prefetch -h##检验是否安装成功
第四条命令如果进入bin目录下会报错：
因为可能是版本不同，命令也发生了变化。
参考：sratoolkit-安装过程中的问题 - zypiner - 博客园 (cnblogs.com)
（2）下载sra序列
现在终于我可以下载啦！
2.解压SRA文件为fastq格式
fastq-dump --gzip --split-files SRR065292
fastq-dump --gzip --split-files SRR070508
由前面查询得到的Run可知，这两个run都有三条reads。
这里我采用的是单独解压，数据文件多可以采用批量解压。
3.用fastqc进行数据质量评价
fastqc SRR065292_1.fastq.gz
fastqc SRR065292_2.fastq.gz
fastqc SRR065292_3.fastq.gz
fastqc SRR070508_1.fastq.gz
fastqc SRR070508_2.fastq.gz
fastqc SRR070508_3.fastq.gz
结果如下：
4.使用multiqc整合
multiqc .
又出现了错误：
解决办法：
1.
pip install matplotlib==2.2.3 https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple/ ##这里添加清华安装源防止出现ReadTimeoutError的报错。
##报错：ERROR: Cannot uninstall 'matplotlib'. It is a distutils installed project and thus we cannot accurately determine which files belong to it which would lead to only a partial uninstall.发现已存在版本matplotlib 1.1.1
cd ./anaconda3/envs/python27/lib/python2.7/site-packages
##删除所有的matplotlib文件或目录
rm matplotlib-1.1.1-py2.7.egg-info
rm -r matplotlib
pip install matplotlib==2.2.3 https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple/
2.
pip install numpy==1.15.0 -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple/
##相同错误：ERROR: Cannot uninstall 'numpy'. It is a distutils installed project and thus we cannot accurately determine which files belong to it which would lead to only a partial uninstall.已存在版本numpy 1.7.1
cd ./anaconda3/envs/python27/lib/python2.7/site-packages
rm numpy-1.7.1-py2.7.egg-info
pip install numpy==1.15.0 -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple/
参考：
1.python2安装matplotlib_qq_43151209的博客-CSDN博客_matplotlib python2
2.https://blog.csdn.net/mahoon411/article/details/112074810
3.https://blog.csdn.net/weixin_45468845/article/details/105494864
删除之前用multiqc .尝试的废用文件，图片所标注。
删除后再输入multiqc .就成功啦
生成了两个文件，1个multiqc_report.html网页报告和1个multiqc_data的文件夹，前者直接网页打开就可以查看，后者包含一些数据基本的统计信息和日志文档。
可以把multiqc_report.html 下载下来到本地，用windows的浏览器打开，也可以直接在图形界面打开查看。
5.结果分析
（1）General Statistics：所有样本数据基本情况统计
%Dups——重复reads的比例
%GC——GC含量占总碱基的比例，比例越小越好
Length——测序长度
M Seqs——总测序量（单位：millions）
（2）Sequence Quality Histograms：每个read各位置碱基的平均测序质量
横坐标——碱基的位置
纵坐标——质量分数
质量分数=-10log10p（p代表错误率），所以当质量分数为40的时候，p就是0.0001。此时说明测序质量非常好。
绿色区间——质量很好，
橙色区间——质量合理。
红色区间——质量不好。
此处可以看出我的2个样本在389个碱基后的测序质量平均线落在红色区间，测序质量不合格。
（3）PerSequence Quality Scores 具有平均质量分数的reads的数量
横坐标——平均序列质量分数
纵坐标——reads数
绿色区间——质量很好
橙色区间——质量合理
红色区间——质量不好
当峰值小于27时——warning
当峰值小于20时——fail
由此图中可以看出低质量reads占整体reads的比例（估算各颜色区域曲线下面积）
图中可以看出：6个样本的最高峰值都在绿色区域，低质量read数量占总体reads的比例比较小，所以这6个样本的该项检测质量是合格的。
（4）Per Base Sequence Content ：每个read各位置碱基ATCG的比列
对所有reads的每一个位置，统计ATCG四种碱基的分布，
横坐标——碱基位置，纵坐标——样本。
%T——红色，%C——蓝色，%A——绿色，%G——紫色。
reads每个位置的颜色显示由4种颜色的比例混合而成，哪一个碱基的比例大，则趋近于这个碱基所代表的颜色。
正常情况下每个位置每种碱基出现的概率是相近的。即·ATCG四种碱基在每一个位置都应该是25%左右。
如果ATGC在任何位置的差值大于10%——warning
如果ATGC在任何位置的差值大于20%——fail
我只有SRR065292_3和SRR070508_3这两个有碱基分布，所以只有这两个样本进行了测序，但所有碱基位置都显示的fail，即所有位置ATCG分布都不均匀，可能是有过表达的序列的污染。
（5）Per Sequence GC Content ：reads的平均GC含量
横坐标——GC含量百分比，纵坐标——数量。
正常的样本的GC含量曲线会趋近于正态分布曲线，曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads）。形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差。
偏离理论分布的reads超过15%时——warning
偏离理论分布的reads超过30%时——fail
从图中可以看出绿色的那个样本检测是合格的，其余5个样本检测是不合格的。
（6）Per Base N Content ：每条reads各位置N碱基含量比例
当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生“N”，统计N的比率。正常情况下，N值非常小。
横坐标——read中的位置，纵坐标——N的数量比。
当任意位置的N的比例超过5%——warning
当任意位置的N的比例超过20%——fail
由图中看出，只显示了我成功测序的两个样本，N值都非常小，检测是合格的。
（7）Sequence Duplication Levels：每个序列的相对重复水平
横坐标：每个序列的相对重复水平，纵坐标：在文库中的比例。
当非unique的reads占总数的比例大于20%时——warning
当非unique的reads占总数的比例大于50%时——fail
测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication，这是正常的现象，但如果duplication的程度很高，就提示我们可能有bias即偏差的存在。
由图可见，我只有两个样本合格，有2个样本序列重复水平很高，还有2个样本没有重复。
（8）Overrepresented sequences：文库中过表达序列的比例
横坐标：过表达序列的比例；纵坐标：样本
过表达序列的比例>0.1%：warning
过表达序列的比例>1%：fail
从图中可以看出我的两个样本3没有过表达，其余的四个样本都超过了1%，两个样本1过表达为100%。这4个样本早已判断肯定是有问题的。
一条序列的重复数，因为一个转录组中有非常多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。这个模块列出来大于全部转录组1%的reads序列，但是因为用的是前100,000条reads，所以其实参考意义不大。
（9）Sequence Length Distribution：序列长度分布
横坐标：序列长度（bp），纵坐标：reads数量
在许多情况下，这将产生一个简单的图，只显示一个大小的峰值，但对于可变长度的FastQ文件，这将显示每个不同大小的序列片段的相对数量。
如果所有序列的长度不相同：warning
如果任何序列的长度为零:fail
对于某些测序平台，有不同的读取长度是完全正常的，所以这里的警告可以忽略。
由于每个序列只有样本3才是合格的，无法将其他两个样本进行比较，事实上，每条序列的所有测出来的样本应该线条趋势一样，峰值一样，这样测出来的序列精确度才最好。
（10）Adapter Content 接头含量
横坐标——碱基位置，纵坐标——占序列的百分比。
超过5%——warning，超过10%——fail。
我的样本中没有发现任何接头含量（污染）超过0.1%。
总的来说，我的两条序列的样本1和样本2都是有问题的，极不准确的。只有样本3是基本合格的，比较好的是两个样本3基本没有重复序列，但GC含量很不正常，很有可能样品存在被污染的情况。
总体参考：
1.https://www.jianshu.com/p/d5d5479c2d39
2.https://www.jianshu.com/p/85da4dcc6020
