人正常肝细胞（WRL68）的培养方法

细胞特性

1. 来源：人的肝组织

2.形态：贴壁生长

3.含量：>1x106

4 .污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

5.规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

WRL68是目前唯一能提供的人正常干细胞，之前很多人一直在问LO2,但是就目前情况来说，LO2在建系的时候就被海拉细胞污染了，所以基本无法提供，所以WRL68的重要性就凸显出来了。

运输和保存：可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式：（1）干冰运输，收到后立即转入液氮或者-80度冰箱冻存或直接复苏；（2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。

细胞用途：仅供科研使用。

细胞接收后的处理：

1.观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

2.贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。

3. 悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。

4.备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议1：2传代 。

细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1.准备MEM（推荐iCell-0012）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2.培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3.冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配

二.细胞处理

1.复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2.细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

A 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

B 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

C 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀

D .将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：第一次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3. 细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例

A.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

B.1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

C.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

注意事项：

1. 收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

2. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。