引言
一直以来，前药都被默认为原药的 “专属运输车”—— 进入体内代谢释放原药，才算完成使命。但 JPA 最新重磅研究，直接推翻这个常识！
研究聚焦绿茶活性成分 EGCG（抗血管生成但极不稳定）及其前药 ProEGCG（稳定性高、治子宫内膜异位症更高效），用无标记 PISA 技术 “扫遍” 全蛋白组，竟发现：ProEGCG 没乖乖变 EGCG，反而以完整形态绑定新靶点 PXK，阻断 EGF/VEGF 信号轴；而 EGCG 只认 MTDH 蛋白、走 PI3K/Akt 通路。
前药居然有“独立技能”？传统筛选技术为啥没发现？PISA 技术又凭啥解锁真相？这篇干货带你看懂科研新突破～
01 颠覆性发现：前药的“双重身份”
在药物研发的惯性思维中，前药（Prodrug）的使命往往被认为是“牺牲自己，成全原药”——它们进入体内后通过代谢释放原药（Parent Drug）来发挥疗效。
然而，近期发表在药学顶刊 Journal of Pharmaceutical Analysis (JPA) 上的一项研究，给这一经典理论投下了一枚震撼弹。
研究对象
▶ 原药 EGCG： 绿茶中的活性成分，具抗血管生成作用，但极不稳定。
▶ 前药 ProEGCG： EGCG 的全乙酰化衍生物，体内稳定性高，对子宫内膜异位症的疗效显著优于 EGCG。
PISA 带来的“意外”真相
研究团队没有沿用“药代动力学（PK）决定疗效”的传统解释，而是利用 PISA (Proteome Integral Solubility Alteration) 技术，在全蛋白组层面进行了一次无标记的“广撒网”。
结果令人咋舌——两者在细胞内的结合图谱（Target Profile）截然不同：
▶ 原药 EGCG：主要“钩住”了 MTDH 蛋白，调控 PI3K/Akt 通路。
▶ 前药 ProEGCG：意外地与 PXK （含丝氨酸/苏氨酸激酶样结构域的PX结构域）发生了高亲和力结合。
机制重构：
通过生物膜干涉实验 (BLI) 验证发现，ProEGCG 正是利用其未被代谢的“完整前药形态”，通过靶向 PXK，直接阻断了 EGF/VEGF 信号轴。
这证明了：ProEGCG 之所以更强，不仅因为它是个更好的“载体”，更因为它本身就是一把开启新通路的“钥匙”。
02 痛点深挖：为什么传统技术“看不见”真相？
既然前药可能有独立机制，为什么在过去的几十年里，这种发现如凤毛麟角？这并非科学家不够努力，而是长期以来，药物靶点筛选受限于“三座大山”。
第一座大山：化学探针的“海森堡测不准原理”
经典的亲和层析（Affinity Chromatography）或光亲和标记（Photo-affinity labeling）是寻找靶点的金标准，但它有一个致命前提：必须对药物进行化学修饰（通常是加生物素 Biotin 或 Click chemistry 标签）。
▶ 位阻效应（Steric Hindrance）： 对于像 EGCG 这样分子量仅为 458 Da 的小分子，引入一个庞大的生物素标签（约 244 Da）甚至连接臂（Linker），相当于“给钥匙焊上了一个保龄球”。
▶ 构效关系破坏： 据 ResearchGate 研究社区的药物化学家讨论，对于前药而言，修饰往往发生在最活泼的基团上，而这些基团恰恰是与蛋白结合的关键位点。标记后的前药，其空间构象发生改变，极易导致假阴性（False Negatives）——即本来能结合的靶点，因为标签的存在而结合不了了。
第二座大山：体外模拟的“环境失真”
为了避开标记，许多研究转向计算机分子对接（Molecular Docking）或基于重组蛋白的SPR/ITC实验。
▶ 缺乏翻译后修饰（PTM）： 细胞内的蛋白往往带有磷酸化、糖基化等修饰，这直接影响药物结合口袋的形状。Sigma-Aldrich 的技术文档明确指出，体外纯化的重组蛋白（尤其是原核表达的）往往是“裸奔”状态，缺乏天然的伴侣蛋白复合物支持，其折叠状态与体内环境差异巨大。
▶ 高假阳性率： Biostars 论坛上的生物信急学专家常戏称 Docking 为“随机数生成器”，因为静态的晶体结构无法模拟蛋白质在细胞内的动态构象变化，导致预测结果往往无法在湿实验中复现。
第三座大山：传统热迁移的“算力与成本噩梦”
细胞热迁移分析（CETSA） 虽然实现了无标记，但为了获得熔解曲线，其实验设计极其笨重。
▶ 通量瓶颈： 传统的 TPP（Thermal Proteome Profiling）需要设置 10-12 个温度梯度。这意味着测试一个药物需要消耗 10-12 个 TMT 标签通道。
▶ 拟合误差： Nature Protocols 曾专门撰文讨论，对数千个蛋白进行非线性的 Sigmoid 曲线拟合，在统计学上是一个巨大的挑战。低丰度蛋白的数据波动极易导致拟合失败，从而产生误导性的 Tm 值变化。
正是这些技术瓶颈，让前药的独立机制长期处于“隐形”状态，也让无数天然产物的机制研究止步于“表型有效”。
03 技术破局：PISA 的“降维打击”
JPA 这篇文章之所以能取得突破，关键在于运用了 PISA 技术。它巧妙地通过“积分”思维，一次性解决了上述所有难题。
PISA（蛋白质组整体溶解度改变）由 Roman Zubarev 团队开发，其核心逻辑在于：不仅看 Tm 值的移动，而是看整个溶解度曲线下的面积变化。
▶ 无需标记（Label-free）：直接将原药/前药投入活细胞或裂解液。ProEGCG 保持了其天然的乙酰化结构，从而被 PISA 敏锐地捕捉到其与 PXK 蛋白的特异性结合。这解决了“测不准”问题。
▶ 高通量积分（High-throughput Integral）：PISA不再纠结于绘制复杂的熔解曲线，而是通过物理混合样品（Pooling），测量蛋白质在整个温度梯度范围内溶解度的积分总和。
【据 Nature Communications 报道，这种方法结合 TMT 标记，将分析通量提高了 10-20 倍。这意味着在一次质谱运行（Run）中，可以同时检测原药、前药、对照组以及多个生物学重复。】
▶ 数据稳健（Robustness）：通过积分，消除了单点测量的随机误差，极大降低了假阳性率（FDR）。
04 实操指南：如何复刻 PISA 实验？
如果您也想探究手头化合物（尤其是结构类似物）的差异化靶点，丸子综合了 Springer Nature Experiments 及 Thermo Fisher 的资料，整理了以下关键路径：
Step 1: 样品孵育 (Incubation)
【关键点】在活细胞或裂解液中加入药物。Biostars 论坛建议，对于疏水性前药，DMSO 终浓度应严格控制在 0.5%-1%，过高会改变全蛋白组的热稳定性基线（Thermal Shift Baseline）。
Step 2: 热处理与积分 (Thermal Challenge & Pooling)
【操作】 设置温度梯度（如 37℃-67℃，共 10-12 个点）。
【核心步骤】加热处理后，不分别检测每个温度点，而是将同一样品的所有温度分组合并到一个管中。
【注意】裂解液的选择至关重要。需使用非变性裂解液，避免 SDS 等强变性剂干扰蛋白的天然热变性过程。
Step 3: 标记与质谱 (TMT & MS)
由于 PISA 节省了温度梯度的通道，可以在一次实验中同时设计：
▶ Vehicle Control（溶剂对照）x 3
▶ Parent Drug（原药组）x 3
▶ Prodrug（前药组）x 3
这极大地消除了批次效应，让微小的靶点差异无所遁形。
05 结语
JPA 这项研究的核心价值，远不止发现一个新靶点 —— 它彻底打破了 “前药只是原药载体” 的固有认知，让科研界重新审视前药的真正潜力：化学修饰赋予的不只是稳定性和吸收效率，更可能是全新的作用机制与靶向特异性。
传统靶点筛选技术的局限，曾让许多前药的 “独立作用” 隐于幕后。而 PISA 技术的突破，为我们提供了一把解锁真相的钥匙 —— 它不是某种 “万能工具”，而是一种让研究回归细胞真实环境、捕捉药物本质作用的思维转变。
未来，当天然产物前药与原药出现表型差异时，不妨跳出 “药代动力学优化” 的单一框架，从靶点层面深挖机制。这场认知革新，或许会让更多被忽视的前药潜能浮出水面，为创新药物研发开辟更广阔的路径。
➡️➡️➡️首个蛋白质组水平无偏倚靶点筛选方法
▶全面直接筛选真实药靶组合：蛋白质组水平筛选药物结合的蛋白靶点，全面覆盖治疗靶点与脱靶靶点；使用药物分子本体进行试验，无需设计合成分子探针，药靶结合更真实
▶多种数据分析策略：结合蛋白热变性曲线分析和非参数分析方法（NPARC），全面捕获潜在药物靶点
▶多种生信分析数据库挖掘辅助筛选：对潜在药物靶点进行生信分析与数据库挖掘，辅助最终药物靶点的确认
▶多种衍生技术可选：除常规温度范围（TPP-TR）、药物浓度范围（TPP-CCR）、两者结合（2D-TPP）的常规热蛋白组分析方法外，还可进行单温度点（ITSA）、多温度点混合（PISA）等高通量热蛋白组分析方法
参考资料
[1] Hung SW, Gaetani M, Li Y, et al. Distinct molecular targets of ProEGCG from EGCG and superior inhibition of angiogenesis signaling pathways for treatment of endometriosis. J Pharm Anal. 2024;14(1):100-114. doi:10.1016/j.jpha.2023.09.005
[2] Hamada Y. Recent progress in prodrug design strategies based on generally applicable modifications. Bioorg Med Chem Lett. 2017;27(8):1627-1632. doi:10.1016/j.bmcl.2017.02.075
[3] Tsuboyama K, Dauparas J, Chen J, et al. Mega-scale experimental analysis of protein folding stability in biology and design. Nature. 2023;620(7973):434-444. doi:10.1038/s41586-023-06328-6
[4] Birkinshaw RW. Correction to: Challenges in small-molecule target identification: a commentary on "BDA-366, a putative Bcl-2 BH4 domain antagonist, induces apoptosis independently of Bcl-2 in a variety of cancer cell models". Cell Death Differ. 2021;28(8):2553. doi:10.1038/s41418-021-00758-3
[4] Biostars: Limitations of Molecular Docking in drug discovery
[5] Nature Protocols: Thermal proteome profiling for unbiased identification of drug targets
[6] Nature Communications: High-throughput thermal proteome profiling (PISA)
[7] Biostars: DMSO effect on thermal shift assays
[8] Springer Nature Experiments: Protocol for Thermal Proteome Profiling
