癌症是全球主要的公共卫生威胁，虽然癌症死亡率自 1991 年达到顶峰以来持续下降，但仅在 2021 年，美国就有超过 60万人死于癌症。2020年，全球有近1000万人死于癌症，近年来一些低收入和中等收入国家的死亡率有所上升。因此，抗击癌症的需求仍然紧迫且未得到满足。研究表明，早期肿瘤检测对于改善癌症患者的预后至关重要。例如，肝细胞癌（HCC） 的早期诊断时的五年生存率为 34%，但晚期诊断（远端转移）时，其生存率则降至3%。因此，开发用于早期癌症检测的检测方法至关重要。血浆中的细胞游离细胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）是肿瘤检测的潜在生物标志物，但其中存在于约10%CpG二核苷酸中的半甲基化（hemi-methylation）模式尚未得到充分研究。

2024年7月20日，美国哥伦比亚大学Zhiguo Zhang（张志国）教授团队在Nature子刊《Nature Communications》杂志发表题为“Tumor detection by analysis of both symmetric- and hemi-methylation of plasma cell-free DNA”的研究论文，研究通过cfMeDIP-seq结合机器学习方法分析了肝脏肿瘤和血浆游离DNA（cfDNA）中的差异半甲基化区域（DHMRs），揭示了大多数DHMRs与相同样本中的差异甲基化区域（DMRs）不重叠，表明DHMRs可以作为独立的生物标志物。同时，通过分析患有肝癌或脑癌的个体样本以及无癌症个体样本（对照组）共计215例样本的cfDNA甲基化组，并利用DMRs、DHMRs或DMRs+DHMRs两者训练机器学习模型。结合DMRs+DHMRs的模型，比只使用DMRs或DHMRs训练的模型表现出更优越的性能，在验证队列中，区分对照组、肝癌和脑癌的AUROC值分别为0.978、0.990和0.983。这项研究支持了同时利用DMRs和DHMRs进行多癌种检测的潜力。

标题：Tumor detection by analysis of both symmetric- and hemi-methylation of plasma cell-free DNA（通过分析血浆cfDNA的对称甲基化和半甲基化来检测肿瘤）

期刊：Nature Communications

影响因子：IF 14.7 / 1区

技术平台：cfMeDIP-seq等

研究思路：

利用改进版甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-Seq）方法，分析来自肝脏肿瘤和脑肿瘤患者以及健康对照组的血浆cfDNA样本。

研究对称甲基化（symmetric methylation）和半甲基化（hemi-methylation）在肿瘤检测中的独立作用。

方案设计：

本研究通过分析肝癌患者、脑癌患者和健康对照者共计215例样本的cfDNA甲基化组图谱，并利用DMRs、DHMRs及两者结合训练机器学习模型。

开发两种甲基化DNA免疫沉淀和链特异性（strand-specific，ss）测序方法（MeDIP-Seq）：基于基因组DNA的ssg-MeDIP-Seq和基于血浆cfDNA的sscf-MeDIP-Seq。使用pA-Tn5转座酶进行DNA片段化和链特异性标记。

使用机器学习模型：训练并分析基于差异甲基化区域（DMRs）和差异半甲基化区域（DHMRs）的数据集。使用GLMnet、随机森林和深度神经网络（DNN）进行模型训练和验证。

研究亮点：

本研究结果揭示大多数DHMRs与相同样本中的DMRs不重叠，表明DHMRs可以作为独立的生物标志物。训练的机器学习模型结合DMRs和DHMRs显示出比单独使用DMRs或DHMRs更好的性能，尤其是在区分对照组、肝癌和脑癌方面。

表明利用DMRs和DHMRs作为生物标志物，通过sscf-MeDIP-Seq方法分析血浆cfDNA，可以提高多癌种检测的准确性。研究支持将cfDNA甲基化和半甲基化分析作为癌症早期检测和分类的潜在手段。

本研究创新性地开发了sscf-MeDIP-Seq方法，能够同时分析cfDNA的对称甲基化和半甲基化。证明了DHMRs作为独立生物标志物在肿瘤检测中的潜力。机器学习模型的结合使用DMRs和DHMRs提高了肿瘤检测的准确性（尤其是在独立验证队列中）。研究提供了一种新的策略，通过分析血浆cfDNA的甲基化模式来检测和分类肿瘤，具有潜在的临床应用价值。

结果图形：

（1）开发基因组甲基化DNA免疫沉淀与链特异性测序方法（ssg-MeDIP-Seq）

图 1：一种基于 pA-Tn5转座酶的MeDIP-Seq方法，用于以链特异性方式分析基因组DNA的甲基化组。 a.    ssg-MeDIP-Seq程序，用于以链特异性方式分析基因组DNA的DNA甲基化。SM对称性甲基化，HM半甲基化。 b.    8个肝脏肿瘤样本与相应邻近非肿瘤组织（Adj-NT）之间的差异性甲基化区域（DMRs）热图。 c.    3个肝癌症样本及相应邻近非肿瘤组织（Adj-NT）样本中TBX2基因位点的肝脏肿瘤 DNA DMR。 d-e.  通过ssg-MeDIP-Seq鉴定的肝癌DMRs与TCGA肿瘤样本中通过450K甲基化芯片鉴定的DMRs进行重叠分析，通过小提琴图（d）和条形图（e）展示。 f.     肝癌DNA DMRs的序列元件富集分析。首先将 DMRs 与每个注释位点重叠，并与随机分布中的重叠数量进行比较，以计算Z分数。P值是通过单侧随机分布计算得出，没有进行多重比较校正。显著富集的序列元件用星号标记，黑色（高甲基化 DMR）和蓝色（低甲基化DMR），每个类别中的DMR数量在括号中显示。(p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001)。

（2）肝脏肿瘤DNA的差异半甲基化区域（DHMRs）和差异甲基化区域（DMRs）可能是独立生物标志物

图2：通过ssg-MeDIP-Seq分析肝癌样本的DNA半甲基化。 a.  对称性甲基化（SM）和半甲基化（HM）示意图。SM指在Watson和Crick两条链上的CpG二核苷酸位点上等量DNA甲基化，而HM区域（HMR）指在一条链上的CpG位点相较于另一条链偏好性甲基化。 b.  两个肝脏肿瘤样本在C1QTNF4基因位点上的肿瘤DNA差异半甲基化区域（DHMR）快照，与其相应的邻近非肿瘤组织（Adj-NT）进行比较，阴影区域表示DHMR。 c.  肝脏肿瘤DNA HMRs的序列富集分析。 d.  8个肝脏肿瘤样本与其相应的Adj-NT相比的6864个DHMRs热图。HM水平以颜色从-1~1显示，其中有2330个肝脏肿瘤DNA DHMRs在Watson或Crick链上显示增加HM，而4534个DHMRs与对照组相比显示减少HM。 e.  8个肝脏肿瘤样本的DMRs和DHMRs与其相应的Adj-NT的重叠比较分析。 f.  与对照样本相比，增加（黑色）和减少（蓝色）的肝脏肿瘤DNA DHMRs的富集分析。 g. 与肝脏肿瘤DNA HMRs邻近基因的GO功能富集分析。 h. 与增加的HM相比，与Adj-NT对照样本中邻近肝脏肿瘤DNA DHMRs的GO功能富集分析。

以上结果表明肝脏肿瘤DHMRs和DMRs很可能是独立的生物标志物。

（3）开发用于分析cfDNA甲基化和半甲基化的sscf-MeDIP-Seq方法

图3：一种用于分析血浆cfDNA甲基化的单链cfDNA甲基化DNA免疫沉淀测序（sscf-MeDIP-Seq）方法 a.  用于分析cfDNA甲基化的sscf-MeDIP-Seq方法概述。SM对称性DNA甲基化，HM半甲基化。单链（ss）DNA上的DNA甲基化为半甲基化区域（HMR）。基于8个input样本，由ssDNA产生的HMR的数量可能很小。 b.  TBX2基因位点的cfDNA DMR快照。阴影区域突出了10个肝脏肿瘤患者的cfDNA样本与10个对照组cfDNA样本的DMR，每组仅显示两个样本。还显示了两个未进行甲基化DNA免疫沉淀的input样本的序列reads片段。 c.   10个肝癌血浆样本和10个非肿瘤对照血浆样本的cfDNA DMR热图。 d-e. 小提琴图（d）和条形图（e）显示通过sscf-MeDIP-Seq鉴定肝脏肿瘤cfDNA DMRs与本研究中使用ssg-MeDIP-seq鉴定的肝脏肿瘤DNA DMRs之间的重叠。 f.    10个肝脏肿瘤样本和10个对照的血浆cfDNA DHMRs热图。 g.   与10个对照相比，10个肝脏肿瘤样本的血浆cfDNA DMRs和cfDNA DHMRs的重叠。

（4）大多数血浆cfDNA中的DHMRs与cfDNA中的DMRs不重叠，使用DMR、DHMR 和 DMRs+DHMR 作为input训练的机器学习模型鉴定癌症类型

表1：本研究中使用的所有271个cfDNA样本的患者信息，包括癌症类型、性别和年龄

图4：使用DMRs和DHMRs以及机器学习模型进行多癌种检测。 a. 机器学习模型训练的流程图。使用单链cfDNA甲基化DNA免疫沉淀测序（sscf-MeDIP-Seq）分析了来自三组（对照组、脑癌和肝癌患者）的271个cfDNA样本甲基化组。215个sscf-MeDIP-seq数据集（占80%）被用作训练队列，剩余的56个（占20%）样本作为独立的验证队列。训练队列用于选择DMR和DHMR并训练机器学习模型，每个样本组使用DMR或DHMR作为训练input，结果产生了10个模型。基于DMR和DHMR的模型然后进一步统一构建最终的校准模型。然后使用训练有DMRs、DHMRs和DMRs+DHMRs作为input的模型评估验证队列。 b-d.  评估模型性能，预测验证队列中的对照组（b）、肝脏肿瘤（c）和脑肿瘤（d）cfDNA样本，使用训练有DMRs、DHMRs或DMRs+DHMRs的模型。每种预测的最高灵敏度和特异性点用红点标记。每个模型的AUC的95%置信区间在括号中标记。 e.  使用训练有DMRs+DHMRs的模型，每组样本的平均预测概率。每一列代表验证样本组，每一行代表模型预测。条形图显示为平均值+标准误差。红色、黄色和蓝色条分别代表20个脑癌、15个肝癌和21个健康对照样本概率。 

（5）通过cfDNA甲基化组区分神经胶质瘤亚型

图5：使用sscf-MeDIP-Seq数据集预测脑肿瘤亚型。 a. 构建脑肿瘤亚型模型流程图。首先使用训练队列样本鉴定的DMR和DHMR训练IDH WT和IDH突变体神经胶质瘤模型，然后将这些模型与基于贝叶斯定理的三类模型（对照组、肝癌和脑肿瘤）结合，得出用于预测四个样本组的模型：IDH WT脑肿瘤和IDH突变体脑肿瘤、肝脏肿瘤和对照样本。 b. 训练DMR、DHMR、DMRs+DHMRs模型在验证队列中预测IDH突变体脑癌样本的评估。 c. 训练DMR、DHMR、DMRs+DHMRs模型在验证队列中预测IDH WT(野生型)脑癌样本的评估。 d. 使用训练DMRs+DHMRs模型，每组样本的平均预测概率。每一列代表验证队列中的样本组，每一行代表模型预测。条形图显示为平均值+标准误差。红色、粉色、黄色和蓝色条分别代表来自11个IDH突变体脑癌、9个IDH WT脑癌、15个肝癌和21个健康对照样本的概率。

（6）血浆cfDNA DMRs与肿瘤组织样本基因表达相关，这些基因表达能够预测患者生存率

图6：基于TCGA肝脏肿瘤组织中具有肝脏肿瘤特异性血浆cfDNA DMR邻近的基因表达对肝癌样本进行分类及患者生存预测。 a. 鉴定在启动子周围至少有一个肝癌cfDNA DMR且其在TCGA肝脏肿瘤组织样本中的表达与患者生存相关基因的流程。 b. 与至少一个cfDNA DMR邻近的150个基因周围的sscf-MeDIP-Seq信号密度。以颜色表示的z分数，是sscf-MeDIP-Seq信号的log2(RPKM)。"HyperDMR"至少有一个高甲基化cfDNA DMR邻近的基因，"HypoDMR"有一个低甲基化cfDNA DMR邻近的基因。 c. 基于上述鉴定的150个标记基因的表达，对TCGA-LIHC队列中的371个肝脏肿瘤样本进行分类。患者被分为两个聚类。颜色代表371个肝癌样本中150个基因的RNA-seq信号的log2(RPKM)的z分数。 d. 对(c)中分为两个聚类的371个肝癌患者进行Kaplan-Meier生存分析。P值通过logrank检验计算。

参考文献：

HuaX, Zhou H, Wu HC, Furnari J, Kotidis CP, Rabadan R, Genkinger JM, Bruce JN,Canoll P, Santella RM, Zhang Z. Tumor detection by analysis of both symmetric-and hemi-methylation of plasma cell-free DNA. Nat Commun. 2024 Jul20;15(1):6113. pii: 10.1038/s41467-024-50471-1. doi:10.1038/s41467-024-50471-1. PubMed PMID: 39030196.