单细胞测序的知识
系统学习单细胞转录组测序scRNA-Seq(一)
单细胞转录组测序主要步骤
- RNA molecule capture
- RT and transcriptome amplification
- sequencing library preparation
- and sequencing
测序方法
- CEL-seq (Hashimshony, 2012)
- CEL-seq2(Hashimshony, 2016)
- Drop-seq(Macosko, 2015)
- InDrop-seq (Klein, 2015)
- MARS-seq(Jaitin, 2014)
- SCRB-seq(Soumillon, 2014)
- Seq-well (Gierahn, 2017)
- Smart-seq (Picelli, 2014)
- Smart-seq2 (Picelli, 2014)
- SMARTer
- STRT-seq (Islam, 2013)
单细胞测序方法包括多种，区别在于两方面：定量方法，tag标签或全长；捕获策略，微孔microwell-，微液流microfluidic-,微滴droplet-。
WGA WTA -Wang Y et al. 2015
细胞分选方法
微流控平台
主要包括顶部的微孔装置和底部的微流控通道。微孔大小可根据需要改变，当捕获到细胞后，翻转装置，能继续培养细胞系。
视频链接
microfluidic platform
flow sorting
flow sorting
细胞分选技术与建库-Hwang B et al. 2018
单细胞建库技术比较
建库过程包括：裂解细胞，游离RNA与附有BC、UMI及接头序列的磁珠连接在引物作用下完成cDNA第一链合成，而后cDNA第二链合成，最后扩增。测序方法通常是Illumina Hiseq技术。
因为有BC（Bead Code）序列，在后期定量时就能够区分该序列属于哪个细胞，从而获得单个细胞文库的测序定量结果。
目前有两种定量方法，基于tag和基于全长。前者对3'端RNA序列测序，通过UMI定量序列，因而对低丰度RNA仍获得比较好的定量结果，但是对分析isoform并不友好；后者获得一致的read 序列，通过序列覆盖度定量，此方法对高表达RNA定量准确性更好。
测序方法建库步骤比较
其他单细胞转录组测序方法
micro-well
micro-well Han XP et al. 2018
sci-RNA-seq3
sci-RNA-seq3 Cao JY et al. 2019
小结
单细胞测序的两个主要难题是，细胞分选及细胞表达文库构建。细胞分选可依据细胞大小、细胞自身电荷属性、细胞与抗体特异性结合等。得到单个细胞即对其打上标签，而后将细胞裂解，根据需要以tag或全长方式构建文库进行测序。
