研究背景 

G-四链体（G-quadruplex, G4）是由富含鸟嘌呤（G）的DNA或RNA序列折叠形成的高级结构[1]。G-四分体（G-quartet）是四链体的结构单元，由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面，两层或以上的四分体通过π-π堆积形成四链体，并且由一价阳离子如Na+或K+离子进一步稳定[2]。由于G4具有重要的生物功能和特殊构象，其结构和功能的特性已成为化学、生物学和药学的重要研究领域。自1962年G4首次被报道至今，人们已经在人类基因组和转录组中陆续发现了大量可以形成G4的DNA或RNA序列，并被证明可以调节多种生物学过程，包括端粒维持、DNA复制、染色质重塑、转录、RNA剪接和翻译等[2]。目前，利用G4稳定配体靶向G4结构已经成为一种有吸引力的疾病治疗策略[3,4]，但是由于G4配体缺乏不同G4结构间的选择性，极大地限制了其临床应用。另外，G4配体已被广泛用于研究G4的生物学功能。同样，由于缺乏选择性，该方法无法精确定义G4与特定生物学过程之间的关系。因此，开发能够在特定基因组位点选择性操控G4折叠的技术对于G4的功能分析和以G4为靶点的疾病治疗至关重要。

近日，中国科学院长春应用化学研究所的曲晓刚研究员团队在Nature Cell Biology期刊上发表了题为Targeting specific DNA G-quadruplexes with CRISPR-guided G-quadruplex-binding proteins and ligands的研究论文。该研究联合CRISPR技术和G4结合蛋白/配体开发出了一种可以选择性靶向特定基因组G4结构的新策略。

图1. 将CRISPR技术与G4结合蛋白/配体结合靶向基因组特定G4结构

CRISPR是DNA的短回文重复序列，是大多数细菌及古细菌中一种不断进化适应的免疫防御机制[5]。CRISPR技术可以将不同的功能蛋白或化合物与催化失活的Cas9（dCas9蛋白）相融合，从而将功能蛋白或化合物招募到特定基因组位点，进行基因转录调控，基因组成像，染色质修饰等[6]。曲晓刚团队通过将G4稳定蛋白核仁素与dCas9蛋白融合，可以特异性地在癌基因MYC、肌肉相关基因Itga7的启动子区以及端粒区中稳定G4结构，分别导致细胞增殖停滞、成肌细胞分化抑制和细胞衰老。进一步，曲晓刚团队利用生物素-亲和素系统将G4配体与dCas9蛋白相偶联，招募G4稳定配体PDS和PDC靶向特定基因组位点的G4结构。与传统G4配体相比，该策略能够更精确地研究新生G4的生物功能。

图2. 以NEAT1和MALAT1 G4s作为代表研究dCas9-SunTag-mSA系统介导Bio-PDC募集到特定 G4 位点的全基因组脱靶效应。a. RNA-seq结果显示，dCas9-SunTag-mSA系统介导的Bio-PDC募集到特定的G4位点后，有163个基上调，49个基因下调；b. MA图显示启动子中G4s基因表达的倍数变化，在这些差异表达基因中，只有93个基因的启动子具有活跃的G4基序

图3. 为了进一步研究这些具有活性G4 motifs的基因的差异表达是否是由于Bio-PDC的脱靶效应所致，研究者利用ATAC-seq分析了经500nM Bio-PDC处理的dCas9-SunTag-mSA/sgR-lncRNAs转染细胞的染色质可及性，结果显示并没有明显改变全染色质的可及性；

图4. e. ATAC-seq结果显示只有六个基因出现了差异表达，并观察到其启动子区域的 ATAC信号强度发生了变化；f. 其中4个基因的启动子区域存在活性G4基序，包括NEAT1 和MALAT1；g.  NEAT1和MALAT的G4基序处ATAC-seq信号增强，但已知的G4驱动的致癌基因信号并没有增加

综上所述，该研究提出了一种可以特异性靶向基因组G4结构的新技术，利用该技术可以更准确地研究G4结构与其邻近基因和各种生物学过程的关系。同时，该技术解决了传统G4配体缺乏选择性的问题，从而在不影响其他细胞内G4的情况下选择性地促进单个或多个目标G4的折叠。此外，该技术未来的研究将进一步揭示G4与其邻近基因及各种生物过程的关联，并为活细胞筛选G4探针或以G4为靶点的候选药物的开发开辟了一条新途径。

图5. 结合CRISPR和G4稳定分子的G4调控转录组工程。通过将每种dCas9-SunTag-mSA 与不同设计的sgRNA配对，研究者可以通过Bio-PDC低浓度给药来独立控制单个或多个感兴趣的G4，而不会对其他细胞G4产生全局影响。

参考文献

[1] Collie GW, Parkinson GN. The application of DNA and RNA G-quadruplexes to therapeutic medicines. Chemical Society reviews. 2011;40:5867-92.

[2] Varshney D, Spiegel J, Zyner K, Tannahill D, Balasubramanian S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature reviews Molecular cell biology. 2020;21:459-74.

[3] Balasubramanian S, Hurley LH, Neidle S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nature reviews Drug discovery. 2011;10:261-75.

[4] Kosiol N, Juranek S, Brossart P, Heine A, Paeschke K. G-quadruplexes: a promising target for cancer therapy. Molecular cancer. 2021;20:40.

[5] Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007;315:1709-12.

[6] Pacesa M, Pelea O, Jinek M. Past, present, and future of CRISPR genome editing technologies. Cell. 2024;187:1076-100.

[7] Qin G, Liu Z, Yang J, et al. Targeting specific DNA G-quadruplexes with CRISPR-guided G-quadruplex-binding proteins and ligands. Nat Cell Biol. 2024 Jul 3.