6mA甲基化-DNA甲基化研究新热点

表观遗传研究

我们常听到这样一种观点：除了先天的基因遗传外，所处的环境与过往的经历对人的塑造同样重要。这个观点生物学上的确存在证据，即在不发生DNA序列变化的前提下，基因功能发生可逆的变化。这种变化的常见的类型如：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体可及性变化等，统称为表观遗传修饰。而引发这些变化的原因，很大部分是生命对所处环境变化做出的响应。表观层面变化引起性状变化的现象十分普遍，例如人老年性黄斑变性疾病（AMD）的产生就是由于染色质开放性变化引起的[1]，植物在干旱、高盐环境中可通过自身RNA甲基化修饰的方式保持RNA稳定，产生抗逆相关蛋白，以适应在逆境中生长[2]。此外，动物的毛色、植物的花色等性状都和表观遗传息息相关。

DNA甲基化修饰

表观遗传研究中最受关注的莫过于DNA甲基化修饰，当我们谈DNA甲基化时，一般讨论的是5mC类型的DNA甲基化（如图1，经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶），包括：CG、CHH、CHG，这种5mC类型甲基化修饰广泛存在于真核生物的C碱基上，通过5mC修饰可以调控相关基因的转录、染色体的形态变化等过程。近20年来，关于5mC修饰调控基因表达的机理被大量挖掘、发表，对5mC修饰从一无所知到今天的习以为常，我们需要花更大的力气才能找到与前人研究不完全重叠的方向。

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图1 5mC类型DNA甲基化事实上，DNA甲基化修饰并不只有5mC一种，还有6mA、4mC等修饰类型，其中6mA修饰（如图2）是一类过去很长一段时间被忽略的甲基化修饰，过去认为6mA仅存在于原核生物DNA中。近年来一系列论文测序研究表明了真核生物（包括人、鼠胚胎、果蝇、水稻等）DNA同样存在着6mA修饰[3][4][5]，由此开启了研究6mA对动物疾病与发育、植物生长等一系列生物学过程影响的新热潮。由于当前学界对6mA修饰的认知较欠缺，因此有关6mA研究的文章受关注程度很高，高质量期刊对6mA文章的接受度也要高一些。

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图2 6mA甲基化修饰

基因组6mA修饰检测技术

当前6mA的研究技术可大致分为两大类型：总量鉴定、高通量测序。1.总量鉴定：即通过斑点杂交（Dot blot）、质谱-色谱联用（LC-MS）等技术检测样品DNA中具有6mA甲基化修饰的A碱基占总A碱基的比值，进而推测样本6mA修饰程度。2.高通量测序：又可以细分为两类1）6mA-IP-seq（使用6mA抗体抓取带有该修饰的DNA片段，进行测序）为代表的区域鉴定手段，可以将6mA修饰位置锁定在几十bp大小的范围内。2）三代测序（Pacbio、Nanopore平台）为代表的单碱基鉴定方法，可以准确检测位点是否发生6mA修饰。Nanopore平台测序基于纳米孔的单分子实时电信号测序技术，DNA 双链在马达蛋白的带领下与镶嵌在生物膜上的纳米孔蛋白结合并解螺旋，在生物膜两侧电压差的作用下，DNA链以一定的速率通过纳米孔通道蛋白，由于 DNA链上不同碱基化学性质存在差异，所以当单个碱基或 DNA 分子通过纳米孔通道时，会引起不同电学信号的变化[6]。通过对这些信号进行检测及对应，即可计算获得相应碱基的类型，完成序列的实时测定（如图3）。

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图3 Nanopore测序原理相比于Pacbio平台的三代甲基化测序，Nanopore拥有着两方面优势：1）单次基因组测序，既可以输出位点6mA修饰数据，还能够输出5mC甲基化，可以获得更全面的基因组甲基化数据。 2）相比于Pacbio要求100X测序深度的数据，Nanopore仅需30X测序深度即可获得准确的6mA甲基化修饰数据，客观上节省了测序成本，让更多研究者可以踏足这个领域的研究。

分析内容

常规6mA分析与5mC的分析内容相似，一般包括了：1）甲基化位点分布特征分析2）甲基化位点motif序列分析3）甲基化相关基因分析4）甲基化与转录组关联分析。通过这四方面分析，可以帮助我们快速挖掘出组间存在差异的甲基化位点，找到这些差异位点的分布特征，并分析差异甲基化引起的下游相关基因的差异表达情况，找出它们的内在关联，进而挖掘甲基化影响表型性状的机制。

小结

1）DNA甲基化是一种生物广泛存在的表观修饰，对生命过程有着重要的影响。2）相比于成熟的5mC研究，6mA研究当前还处于起步阶段，概念与技术都存在着相当大的潜力，有助于发表高水平期刊。3）6mA三代测序平台Nanopore拥有着精度高、研究面广、价格门槛低、性价比高等优势。4）数据分析上，6mA可以借鉴5mC的分析思路进行开展，不需要过多的摸索过程，可以大幅度缩短数据分析周期。