这篇文章解析了分辨率更高的EP4激活结构，并且对比了EP4偶联Gs/Gi的结构上的差异。在阐述G蛋白选择性的机制上做的非常细致，个人认为学习本文献后对于提升结构生物学‘讲故事’的有较大的启发。

背景介绍：

一种激素发挥不同的生理功能有三种方法：

（1）作用于不同的受体

（2）作用于同一受体并在下游产生不同的效应细胞

（3）GPCR的选择性剪切和翻译后修饰

下游效应G蛋白选择性的结构性基础目前尚不清晰。例如，前列腺素E2的受体EP4既可以激活下游Gs也可以激活下游Gi。当Gs激活时可以发挥注入肾脏保护、扩血管和降低肾小球肾炎发病率等作用。但其激动剂是更倾向于激活Gs还是Gi，以及其中的结构基础目前尚不清晰，这也不利于开发选择性激活Gs/Gi 信号通路的EP4激动药物。

不同EP4激动剂有着使EP4偶联不同G蛋白的倾向性：L902688和Rivenprost 都属于EP4激动剂，但前者倾向于激活Gi后者则倾向于激活Gs。作者首先统计了两种药物的biased factor β-value，发现对两种药物对Gs/Gi有着明显的选择性（Figure S1C），选择窗口高达10-100倍，因此非常适用于EP4 的G蛋白选择性研究。

FIg. S1

作者接下来探究了EP4激动剂对于肾脏保护作用的信号机制，发现对顺铂引起的AKI，Rivenprost具有明显的降低SCR、BUN、KIM-1等身脏损伤marker的作用，而L902688则没有这种作用。当Cdh16Cre+/Gnasflox/flox 选择性敲除肾小管的Gαs后该作用消失。这提示Gs-biased EP4 激动剂有更好的肾脏保护的治疗作用。

Fig. 1

为了探究EP4-G蛋白选择性的作用机制，作者解析了不同激动剂激活的EP3-Gi, EP4-Gs, and EP4-Gi 结构。在大体上EP4与EP2，EP3非常相似，有着X型的ECL2。 作者发现，L902688配体在Gs偶联和Gi偶联的EP4上有着显著的差异，前者的结合口袋非常深（多5.7 Å），而后者则相对较浅。与此同时，PGE2在Gs/Gi-EP4的结合口袋中的构象也有着明显差距。相同配体激活的GPCR在偶联不同G蛋白却有不同的口袋位置和构象差异，这提示EP4结合口袋的构象差异在不同的G蛋白信号传递上可能有重要作用。

Fig. 2

PGE2在不同PGE2受体中的构象差异：PGE2 α-chain在EP2，EP3和EP4中较为相似，都有明显的Y（3.32）T（ECL2）R（7.40） motif和L/M（3.32）-L（7.36）motif。但EP2-Gs中的PGE2配体位置要明显低于EP4和EP3。这可能是因为EP2中的部分氨基酸，如T82（2.54），S308（7.46）在EP3中为侧链更大的Q103（2.54）和Q339（7.46），使得其进入配体口袋更加顺利。这提示不同的氨基酸序列可以导致同一配体在构象上的不同。

EP4-Gs和EP4-Gi中配体PGE2位置构象的差异：相较于EP4-Gs，EP4-Gi中PGE2的E-环发生了60度的偏转，同时其α-chain也发生了约60度的旋转。这样Gi-EP4相比于EP4-Gs额外与T69形成了氢键，而缺少了与T168形成的氢键。同时，ω-chain也发生了大约18度的偏转，从而额外与I315形成了相互作用而与F102 不再有疏水作用。功能试验体会，T69A，I315A和I315S得突变对EP4-GI激活的影响远大于EP4-Gs，而F102则对EP4-Gs的激活影响更大。这提示相同配体的不同结合构象可以直接影响EP4激活后结合下游G蛋白的选择性。

S11C

Fig3C

ω-Chain也与G蛋白偶联的选择有关：作者通过分析结构发现，不同的受体中PGE2的主羧基链和E-环基本相似，但ω-Chain方向有所差异偶联Gi的EP3的ω-Chain更加上抬，而偶联Gs的EP2则下偏。同时，偶联了不同G蛋白的EP4中，PGE2的ω-Chain方向也有所差异。其中，偶联Gi的EP4-PGE2的ω-Chain更接近于EP3-PGE2，而偶联Gs的EP4-PGE2的ω-Chain更接近EP2-PGE2。EP2、EP3、EP4的中PGE2的ω-Chain的不同方向分布，在空间上形成了形似‘金鱼尾‘的分布。

Fig S11-G-I

同时，作者还根据EP2，EP3中与配体ω-Chain相互作用的不同氨基酸，对EP4进行了突变。当把EP4的等位氨基酸突变成EP2上的氨基酸时（EP4-MTLS），让EP4更倾向于偶联Gs蛋白。相反，当突变成EP3上的氨基酸时（EP4-QGSQ），则使得EP4更倾向于结合Gi蛋白。这也提示了ω-Chain的摆动方向和结合位置是可以显著影响G蛋白偶联的选择性的。

Fig. 3

EP4药物选择性的结构基础：作者通过将EP4与不同家族对比发现了决定配体对EP4选择性的氨基酸。Reviprostt和L902688在T76（2.61）与EP4形成了氢键，而在其他EP受体中该位置被替换为了V（2.61）。S103（3.36）与ω-Chain的醚基团形成了氢键，而EP1和EP3中该位置为G（3.36）。同时，EP2中的L（7.42）在EP4中为A318（7.42），更小的丙氨酸使得ω-Chain的醚基团能伸的更远，从而直达TM3上的L99（3.32）。而对应的突变也显著降低了其受体的激活。

Fig.4

受体结合口袋的不同，对EP4 G蛋白结合选择性的影响：作者对比EP4-Gs/Gi 的配体构象发现，结合了不同G蛋白的受体内配体的结合构象有着明显差异。L902688在EP4-Gs中的位置比在EP4-Gi低了6 Å。并且，其ω-chain也与EP4中更深的P322（7.46） 和S103（3.36）额外形成了相互作用。功能试验也提示，P322（7.46） 和S103（3.36）对EP4-Gs的激活影响更大。结合前文，F102（3.36）、P322（7.46） 和S103（3.36）对于EP4 G蛋白的选择性有着明显的影响。

Fig5A

与此同时，作者也发现，结合Gs的EP4结构中，TM3与TM6的间距跟大，这也表明受体本身的构象也可以影响G蛋白的选择性

Fig. 6B-C

前列腺素家族Gs/Gi蛋白偶联选择性的特点：通过对比不同前列腺素受体与G蛋白的相互作用面作者发现，EP4中的Y55（2.40）、F217（5.72）、E267（6.30）与EP3有明显不同，这提示上述氨基酸可能参与到Gs/Gi的选择。顺着这个思路，将EP4的F217（5.72）和EP2的S229（5.70）突变为EP3中的K263（5.72）后，原来与Gs存在的阳离子-pai作用会丧失，取而代之引起排斥作用。同时EP2的E267（6.30）和EP4的T277（6.30）替换为EP3的T277（6.30）则会使得其与Gs蛋白上的R385的电荷作用丧失。这些结果提示TM2、TM5和TM6对于Gs蛋白的选择有重要作用。而对于Gi蛋白偶联的选择性，作者发现Y（ICL2）和M270（6.33）起到了主要的作用。

FigS16

总的来说，这篇文章有以下发现

（1）EP4激动剂主要通过偶联Gs通路发挥对肾脏损伤的保护作用；

（2）相同配体可以通过不同的构象和姿势结合与EP4，影响EP4偶联G蛋白的选择性；

（3）EP4受体本身的构象，也可以影响G蛋白的选择性；

（4）在G蛋白的偶联界面上有两组不同的氨基酸，他们分别影响了EP4与G蛋白偶联的选择性。