part1： 释义

在单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）分析中，几个与细胞质量评估相关的关键指标，以及如何解读条形码（barcode）排名图。这些指标帮助我们了解测序数据的质量、细胞的捕获情况、UMI（Unique Molecular Identifier）计数和基因的表达情况。下面我会详细解释每个术语及其含义。

1. Cells（细胞）

   • 这是指在实验中检测到的实际细胞数量。这个值是通过分析与细胞相关联的条形码（barcodes）来估算的。条形码是单细胞测序中用于标记和区分不同细胞的序列。

2. Estimated Number of Cells（估计细胞数量）

   • 估计的细胞数量是指至少与一个细胞相关联的条形码的数量。每个条形码对应一个单细胞，因此通过统计这些条形码的数量可以估算实验中捕获的细胞总数。这个指标帮助你了解实验捕获了多少细胞。

3. Fraction Reads in Cells（细胞内的读段比例）

   • 这是指那些拥有有效条形码并且被精确地映射到基因组的序列读段（reads）中，有多少比例是与细胞条形码相关联的。这个值的高低可以反映测序数据的质量。如果比例较高，意味着大部分读段确实来源于细胞，而非背景噪音。

4. Mean Reads per Cell（每个细胞的平均读段数）

   • 这是指测序读段的总数除以细胞条形码的数量，计算出每个细胞平均分配到的读段数量。这个指标帮助你了解每个细胞捕获了多少测序数据，通常反映实验中的数据深度。

5. Median UMI Counts per Cell（每个细胞的中位UMI计数）

   • UMI是指测序时为了去除PCR扩增偏差而使用的唯一分子标签。这个指标表示每个细胞条形码关联的UMI计数的中位数，帮助你了解在不同细胞之间，UMI的分布情况。UMI数的多少可以反映出每个细胞中检测到的转录本数量。

6. Median Genes per Cell（每个细胞的中位基因数）

   • 这个指标表示每个细胞条形码检测到的基因数的中位数。基因检测是基于至少有1个UMI计数的基因。这帮助你了解每个细胞中平均表达了多少个基因，通常用于评估测序数据的复杂性。

7. Total Genes Detected（检测到的总基因数）

   • 这是指在所有细胞中，至少有一个UMI计数的基因总数。这表明整个数据集里，有多少基因在至少一个细胞中表达。这可以反映出实验中基因表达的广度。

8. Barcode Rank Plot（条形码排名图）

   • 该图显示了每个条形码的UMI计数（即与每个条形码关联的UMI数量）。条形码的排名是根据UMI计数的降序排列，排名靠前的条形码往往对应着含有更多UMI计数的细胞。需要注意的是，条形码是否与细胞相关联不仅仅取决于UMI计数，还可能根据表达特征进行判定。图中还可能显示通过蛋白聚集检测和过滤（Protein Aggregate Detection and Filtering）或高占用GEM（Gel Bead in Emulsion）过滤（High Occupancy GEM Filtering）去除的背景条形码。
   • 在条形码排名图中，不同颜色表示不同区域的条形码密度，帮助你区分哪些条形码与细胞有关，哪些与背景噪音有关。当你悬停在图上的某个区域时，会显示该区域中条形码被判定为细胞的数量及百分比，同时显示该区域的条形码的UMI计数和条形码排名。

   
   
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part2： 范围

在单细胞RNA测序分析中，不同实验的条件、测序平台、细胞类型等因素都会影响这些质量控制（QC）指标的合理范围。因此，具体数值的“合理性”需要结合实验背景来评估。以下是一般情况下，每个指标的参考范围和判断标准：

1. Estimated Number of Cells（估计细胞数量）

   • 参考范围：根据实验的设计，捕获的细胞数量通常在几千到几十万之间不等。如果使用10X Genomics平台，通常单次实验可以捕获大约3000到10万的细胞。
   • 判断标准：估计细胞数量应符合实验设计。如果捕获的细胞数明显低于预期，可能意味着细胞捕获效率较低，或者部分细胞丢失。如果过高，可能表明有噪音或污染存在。

2. Fraction Reads in Cells（细胞内的读段比例）

   • 参考范围：一般来说，该值应高于60%-80%，意味着大部分测序读段来自真实的细胞条形码。如果这个比例过低，说明很多读段可能是噪音或背景。
   • 判断标准：如果比例低于60%，则表明实验中的条形码分配存在问题，或者细胞捕获效率较低。理想情况下，该值应越高越好。

3. Mean Reads per Cell（每个细胞的平均读段数）

   • 参考范围：对于10X Genomics平台，每个细胞通常至少有2万-5万读段，达到高覆盖度的实验可以达到10万读段或更多。
   • 判断标准：如果每个细胞的平均读段数低于1万，可能表明测序深度不够，导致数据质量不高。如果数值过高，可能存在数据冗余，表明测序深度超过了所需。

4. Median UMI Counts per Cell（每个细胞的中位UMI计数）

   • 参考范围：该值通常在数千至数万之间，具体取决于实验设计和细胞类型。常见范围为1000到5000左右的UMI计数。
   • 判断标准：UMI计数越高，意味着在每个细胞中检测到的转录本越多。如果中位UMI计数低于500，可能表明捕获效率低或测序深度不足。

5. Median Genes per Cell（每个细胞的中位基因数）

   • 参考范围：对于哺乳动物细胞，通常每个细胞会检测到1000-3000个基因。如果是某些高度活跃的细胞（如免疫细胞），这个值可能更高。
   • 判断标准：每个细胞的中位基因数应至少在800-1000个以上。如果远低于这个数值，可能表示实验数据的覆盖率或细胞活性较差。如果检测到的基因数过多，也可能提示捕获了一些双细胞（doublet）或存在噪音。

6. Total Genes Detected（检测到的总基因数）

   • 参考范围：检测到的基因总数通常取决于实验的深度和细胞类型。一般情况下，可以检测到20000-30000个基因。
   • 判断标准：这个指标反映了整个数据集的基因表达广度。如果检测到的基因数过少，可能是测序深度不够或细胞活性较差。反之，如果总基因数过高，可能意味着有噪音或双细胞污染。

7. Barcode Rank Plot（条形码排名图）

   • 参考解读：条形码排名图的目的是帮助你区分细胞条形码和背景噪音条形码。通常情况下，在条形码排名图的高UMI部分会看到一个“膝盖”形状的拐点，拐点之前的条形码被认为是真正与细胞关联的，之后的条形码则是背景噪音或低质量条形码。
   • 判断标准：拐点清晰，且前半部分条形码的UMI计数较高（通常每个条形码UMI计数大于100），表示细胞与背景条形码区分明确。如果没有明显的拐点，或者很多条形码的UMI计数较低，可能表明实验数据中存在较多背景噪音或低质量条形码。

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