第二十一章：毛细管电泳法

毛细管电泳法CE/HPCE：以高压直流电为驱动力，毛细管为分离通道根据样品各组分的电泳和分配行为差异而实现分离的一类分析技术。由于毛细管散热效率高，可以应用更高电压

特点：操作简单、分离效率高、样品用量少、运行成本低

缺点：迁移时间重现性、进样准确性、检测灵敏度低于HPLC，不适于制备性分离

第一节：毛细管电泳基础理论

电渗和电渗率

电渗：液体相对于带电管壁移动的现象

Zeta电势：在电场作用下，固液两相的相对运动发生在紧密层和扩散层之间的滑动面上，此处的电动电势即为Zeta电势百科解释：Zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差

电渗流EOF：由于离子是溶剂化的，当扩散层的离子在电场中发生迁移时，将携带溶剂一起移动，形成电渗流

$u_{os}=\mu_{os}E=\frac{\varepsilon\zeta_{os}}{4\pi\eta}E$ , $\mu_{os}$ 是电渗淌度， $\varepsilon$ 是介电常数， $\eta$ 是黏度

在普通毛细管电泳条件下，电渗流从正极流向负极。Zeta电势越大、双电层越薄、电荷密度越大、粘度越小，电渗流越大。一般电渗流速度是电泳速度5~7倍

石英毛细管表面硅羟基离解随pH升高而增大，引起界面有效电荷密度增大，电渗流增大
当溶液中含有阳离子表面活性剂时，阳离子表面活性剂通过强的静电作用吸附在毛细管壁上，减小了界面有效电荷密度，甚至使内壁带相反电荷，使电渗流减小或反转
在缓冲溶液中加有机溶剂（甲醇、乙腈），能抑制电渗流

电泳和电泳淌度

电泳是在电场作用下，带电粒子在缓冲溶液中定向移动的现象

$u_{ep}=\mu_{ep}E=\frac{\mu_{ep}V}{L}$ ，V为毛细管两端电压，L为毛细管总长度

对于一个离子淌度可近似为： $\mu_{ep}=\frac{\varepsilon\zeta_{i}}{4\pi\eta}$ ， $\zeta_i$ 为离子的Zeta电位，表面电荷越大，质量越小，Zeta电势越大

在实际溶液中离子活度系数、溶质分子的离解程度均对离子的淌度有影响，用 $\mu_{eff}$ 表示

表观淌度

粒子在毛细管内运动速度是两种速度矢量和称为表观淌度用 $\mu_{ap}$ 表示

分离效率和谱带展宽

理论塔板数和塔板高度

$n=5.54(\frac{t_m}{W_{1/2}})^2$ ， $H=\frac{L_d}{n}$ ，t_m为流出曲线最高点所对应的时间称为迁移时间，L_d为有效长度（进样端到检测端的距离）

毛细管电泳法分离柱效方程： $n=\frac{\mu_{sp}VL_d}{2DL}$

增大电压，增大L_d/L可以提高柱效，大分子物质扩散系数小，所以分离效果好，毛细管电泳法特别适用于生物大分子

引起谱带展宽的因素

电渗流驱动下扁平流

扩散：纵向扩散是谱代展宽的唯一因素， $\sigma^2=2Dt_m$ ，凡是影响扩散的因素都影响谱带宽度
焦耳热：焦耳热通过管内壁向周围环境中扩散时，早毛细管内形成抛物线型径向温度梯度，径向温度梯度影响溶液黏度产生粒子迁移速度的径向不均匀，导致区带展宽。通过增大内外径之差增加散热面积，降低缓冲液浓度降低焦耳热影响
吸附：指毛细管壁对被分离物质粒子的作用。阳离子溶质和带负电的毛细管壁静电作用，疏水作用。细内径毛细管不利于降低吸附，生物大分子分析时常需要用内壁涂层处理的毛细管柱

分离度

$R=\frac{t_{m_2}-t_{m_1}}{4\sigma}=\frac{\sqrt{n}}{4}\cdot\frac{\Delta u}{\bar u}$

影响因素：

外加电压
有效柱长和总长度之比
电泳有效淌度差
电渗淌度

第二节：毛细管电泳法主要分离模式

毛细管电泳法分类

按填充物质性状：自由溶液、非自由溶液

按分离机制：电泳、色谱、电泳/色谱

除凝胶电泳法和电色谱法需用填充型分离柱外其余几种仅是基于使用的运行缓冲溶液（BGE）不同

毛细管凝胶电泳法（CGE）、毛细管等电聚焦法（CIEF）、毛细管等速电泳法（CETP）主要用于生物大分子

药物分析常用毛细管区带电泳CZE和胶束电动毛细管色谱法MECC

毛细管区带电泳法

分离机制：依据电泳淌度分离，正离子先出，中线分子无法分离，带相同电荷离子按荷质比分离
实验条件选择：
1. 分离电压：随电压变化分离效率存在极大值，分离效率极大时的电压称为最佳工作电压。
2. 缓冲溶液种类：在所选pH范围有足够大缓冲容量；与检测器相匹配；自身淌度低，分子大而荷电小；使被测组分带合适电荷量；尽可能采用酸性pH条件减少吸附和电渗；与毛细管种类匹配；使用高纯水配置
3. 缓冲溶液浓度：随浓度增加，离子强度增大，溶质和管壁间，被分离组分间相互作用降低，电渗率降低，迁移速度降低，焦耳热增加
4. 缓冲溶液pH：酸性组分在碱性，碱性组分选酸性，两性都可选；糖类9~11，羧酸类5~9；随pH增大，电渗增大
5. 添加剂：无机电解质可压缩取代，抑制蛋白质吸附，但是增加焦耳热；高分子类添加剂可以形成分子团或特殊局部结构，影响迁移过程；甲醇、乙腈可抑制电渗流

胶束电动毛细管色谱法

胶束电动色谱法MEKC：是以胶束为假固定相的一种电动色谱法。又称胶束电动毛细管色谱法（MECC）

可以分离CZE中无法分离的中性化合物

胶束假固定相：
1. 阳离子表面活性剂吸附在石英毛细管上，可减慢电渗流速度或使电渗流转向，称之为EOF改性剂
2. 组成一个胶束的分子数叫聚集数（n）
分离机制：中性溶质在随电渗流移动的过程中，在水相和胶束相之间进行分配，基于其与胶束作用强弱差异，在两相间分配系数不同而得到分离
流动相：改变胶束（种类和浓度）和缓冲体系（种类和浓度）会改变溶质分配系数，进而对容量因子和迁移产生影响。pH影响MECC中带电组分迁移速度和电渗速度，但不影响SDS荷电状况；向缓冲溶液中加有机溶剂会改变水溶液极性，条件分配系数，提高分离选择性

毛细管电色谱法

毛细管电色谱法CEC：是在毛细管内填充、内壁涂覆、键合或交联色谱固定相，以电渗流驱动流动相完成分离的微柱色谱技术

分离机制：被测组分根据它们在流动相和固定相中的分配系数不同和自身电泳淌度差异得以分离
分离条件选择：首先固定相，其次流动相和缓冲液。根据固定相和流动相性质，CEC可分为反相、正相、离子交换和分子交换。使用的色谱柱有填充柱、开管柱、整体柱

缓冲液可以是水溶液或有机溶液。pH对溶质的保留影响很大，在pKa附件调节pH易于获得较高选择性。为煎炒焦耳热，流动相通常采用低浓度缓冲溶液。

常规条件无法改善分离时，可以考虑加压毛细管色谱（P-CEC）或混合固定相填充CEC柱

气泡陈胜时导致分离失败的主要原因，一般出现在样品塞子与填料交界处。采用P-CEC可以避免气泡产生，缩短分离时间

第三节：毛细管电泳仪

包括高压电源、电解液槽和进样系统、毛细管及其温控系统、检测器、记录数据处理系统

高压电源

防止高压放电：干燥、隔离、降低分离电压

毛细管柱

常用弹性熔融石英毛细管。

对于从未使用过的未涂渍柱，使用前用5~15倍柱体积NaOH，水，及3~5倍柱体积运行缓冲溶液冲洗（平衡毛细管），或增加有机溶剂如甲醇清洗步骤。更换缓冲溶液也需要用运行缓冲溶液平衡。

对于蛋白质等需要对毛细管比进行改性处理（物理涂覆、化学键和、交联）

进样系统

采用无死体积进样方式，进样系统包括动力控制、压力控制、计时控制、电极槽或毛细管移位控制

压力进样：填充介质有流动性，选择性差（组分和基质都同时被引进管中）
电动进样：对填充介质无要求，基质影响小，对离子组分存在进样偏向，基质变化影响重现性
扩散进样：对介质无要求，扩散具有双向性（抑制背景干扰），无进样偏向

常用压力进样

检测器

柱上检测（毛细管出口端除去不透明保护层）：紫外、荧光

柱后检测：电化学、质谱

激光诱导荧光（LIF）：常用氩离子激光器

第二十一章：毛细管电泳法

第二十一章：毛细管电泳法

第一节：毛细管电泳基础理论

电渗和电渗率

电泳和电泳淌度

表观淌度

分离效率和谱带展宽

理论塔板数和塔板高度

引起谱带展宽的因素

分离度

第二节：毛细管电泳法主要分离模式

毛细管电泳法分类

毛细管区带电泳法

胶束电动毛细管色谱法

毛细管电色谱法

第三节：毛细管电泳仪

高压电源

毛细管柱

进样系统

检测器

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