一、什么是亚细胞定位
亚细胞定位即指某种生物大分子物质或脂类在细胞内存在的具体位置。蛋白质的功能、代谢以及相互作用等都与其亚细胞定位密切相关，成熟蛋白质必须在特定的亚细胞结构中才能发挥正常的生物学功能，如果定位发生偏差，将对细胞功能甚至生命产生重大影响，因此对蛋白质亚细胞定位的研究具有重要意义。
目前，蛋白质亚细胞定位研究中最广泛采用的策略是融合报告基因定位法。该技术通过检测与目标蛋白融合的报告基因（如荧光蛋白）表达产物的分布，实现对目标蛋白的亚细胞定位分析。其实验流程可概括为将目标蛋白与荧光蛋白的N端或者C端融合，通过瞬转或稳转，使该融合蛋白在受体材料细胞内表达，目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器，经过激光共聚焦显微镜（Confocal microscopy）激光照射，荧光蛋白会发出荧光，通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置，从而确定目标蛋白的定位。
二、主要应用范围
确定蛋白质这类生物大分子的胞内定位，从而有助于推测其可能参与的生物学过程和功能，应用于蛋白质功能研究、作物遗传改良、药物靶点研究、疾病机制探索等研究领域。
三、案例展示
1.烟草系统
2025年4月，浙江大学水稻生物学与育种国家重点实验室王晓伟教授团队在《Science Advances》期刊上发表了一篇题为“Auxin-salicylic acid seesaw regulates the age-dependent balance between plant growth and herbivore defense”的研究论文，选取本氏烟草作为主要实验材料揭示的生长素和水杨酸协同调控植物生长发育与防御韧皮部取食昆虫粉虱的分子机制中NbARF18La/b-NbMYB42-NbPAL6信号通路发挥着重要作用。论文中，作者构建出pCAMBIA1305-NbMYB42-GFP、pCAMBIA1305-NbARF18La-GFP、pCAMBIA1305-NbARF18Lb-GFP和 pCAMBIA1305-GFP （空载体） 用于亚细胞定位，通过根癌农杆菌工程菌株EHA105转化到 H2B-RFP 转基因本氏烟草植物的叶子后，使用共聚焦显微镜观察分析：
图3B:NbMYB42-GFP在本氏烟草H2B-RFP系中的核定位
图4C：NbARF18La/b-GFP在本氏烟草H2B-RFP系中的核定位
发现可激活NbPAL6启动子的表达的R2R3-MYB家族核TF NbMYB42位于细胞核中，而且能特异性结合NbMYB42启动子上同一AuxRE位点的两种NbARFs：NbARF18La和NbARF18Lb都位于细胞核中。
2.原生质体系统
中国农业大学胡兆荣教授团队在2024年4月发表于《Science Advances》的研究“The potassium transporter TaNHX2 interacts with TaGAD1 to promote drought tolerance via modulating stomatal aperture in wheat” 中，系统解析了液泡膜定位的K+/H+逆向转运蛋白TaNHX2通过GABA信号通路调控小麦抗旱性的分子机制。论文中，作者在从小麦叶片分离的叶肉原生质体细胞中研究TaNHX2 的亚细胞定位：
图1B：TaNHX2在小麦原生质体中的液泡定位
3.293T细胞
山西医科大学基础医学院李莉教授团队于2024年6月发表一篇题为“The Study of SRSF1 Regulates Abnormal Alternative Splicing of BCL2L11 and the Role in Refractory Acute Myeloid Leukemia”的研究成果，证明了剪接因子SRSF1的过表达及由此导致的线粒体跨膜蛋白BCL2L11异常选择性剪接与急性髓系白血病的耐药和不良预后有关。论文中，作者使用HEK-293 T细胞作为研究亚细胞定位的工具：
图4e：BCL2L11 miniGene在HEK-293T细胞中的线粒体定位
四、南京瑞源生物亚细胞定位服务体系
1.南京瑞源生物动物、植物亚细胞定位可选marker一览表
2.技术优势
（1）技术路线成熟：
可进行亚细胞定位及亚细胞共定位技术服务，基于高精度亚细胞共定位分析平台，高效辅助蛋白质之间的相互作用机制和基因功能研究。
（2）服务体系广泛：
可利用烟草叶片，原生质体（烟草、拟南芥、水稻）和哺乳动物293T细胞等转化系统，系统性地为客户提供从质粒载体构建、动植物亚细胞定位、蛋白互作分析、功能验证等定制化技术服务。
（3）实验标准严谨：
实验全流程的技术可靠性与数据可重复性，支持输出SCI期刊规范处理图片。
3.样本要求
4.南京瑞源生物亚细胞定位交付图片示意图
（1）烟草系统
植物烟草叶片体系亚细胞定位示例图（A蛋白定位于细胞核）
（2）原生质体系统
（3）293T细胞
293T细胞亚细胞定位示例图（目的蛋白可能在细胞膜中有定位）
五、常见实验问题
1.亚细胞定位与亚细胞共定位的区别？
亚细胞共定位就是在普通亚细胞定位的基础上，同时转入一个Marker载体，以明确目标蛋白具体的定位信息，相比于普通亚细胞定位，共定位得到的结果更加准确。
2.为什么要提供GFP空载的对照图片？
（1）作为整个实验过程中的操作参照，可排除因实验操作而导致目的基因没有荧光信号的影响。
（2）作为载体体系的参照，确认构建载体时所使用的载体是可正常表达荧光蛋白的。
3.拍摄时为什么有明场通道？
（1）显示细胞状态，有活力的细胞应该有正确且明显的细胞形态，变形或破碎的细胞说明此时细胞不是最适状态或细胞已死亡。
（2）显示荧光确实是细胞内蛋白表达的，而不是细胞碎片及杂质产生的杂光。
4.构建亚细胞定位载体时，GFP融合位置为什么有N端、C端之分？
若序列中存在信号肽，则构建载体时需避开这一端来融合荧光蛋白。需注意不同的融合方式可能会得到不同的定位结果，例如融合在荧光蛋白N端的目标蛋白一般无法得到过氧化物酶体的定位结果；融合在荧光蛋白C端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。
5.为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样？
不同物种的细胞在翻译表达基因时，其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响，同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同，因此建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。
6.辅助亚细胞定位的在线预测网站有哪些？
（1）UniProt综合性的蛋白质序列和功能信息注释数据库
（2）Cell-PLoc 2.0真核生物、原核生物、植物、古菌等物种预测工具
http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/
（3）iPSORT亚细胞定位预测工具
（4）cNLS Mapper 核定位信号预测工具
http://nlsmapper.iab.keio.ac.jp/cgibin/NLS_Mapper_form.cgi
（5）SignalP 4.0 Server 信号肽和信号肽剪切位点预测工具
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/
（6）ChloroP 1.1 Server 叶绿体转运肽 (chloroplast transit peptides, cTP) 预测工具
http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/
（7）TargetP 2.0 信号肽 (Signal peptide, SP)，叶绿体转运肽 (chloroplast transit peptide, cTP)，类囊体转运肽 (thylakoid luminal transit peptide, lTP) 预测工具
https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0
（8）WoLF PSORT II 亚细胞定位预测工具
https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar
（9）DeepLoc-2.1真核蛋白亚细胞定位和膜蛋白类型预测工具
https://services.healthtech.dtu.dk/services/DeepLoc-2.1
（10）CELLO 基于支持向量机（SVM）机器学习算法的蛋白质亚细胞定位预测工具
http://cello.life.nctu.edu.tw/
六、参考文献
[1] Chaturvedi NK, Mir RA, Band V, et al. Experimental validation of predicted subcellular localizations of human proteins. BMC Res Notes. 2014 Dec 15;7:912.
[2] Nelson BK, Cai X, Nebenführ A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 2007 Sep;51(6):1126-36.
[3] Pagny S, Bouissonnie F, Sarkar M, et al. Structural requirements for Arabidopsis beta1,2-xylosyltransferase activity and targeting to the Golgi. Plant J. 2003 Jan;33(1):189-203.
[4]Chakrabarty R, Banerjee R, Chung SM, et al. PSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol Plant Microbe Interact. 2007 Jul;20(7):740-50.
[5] Han WH, Zhang FB, Ji SX,et al. Auxin-salicylic acid seesaw regulates the age-dependent balance between plant growth and herbivore defense. Sci Adv. 2025 May 9;11(19):eadu5141.
[6] Li J, Liu X, Chang S, et al. The potassium transporter TaNHX2 interacts with TaGAD1 to promote drought tolerance via modulating stomatal aperture in wheat. Sci Adv. 2024 Apr 12;10(15):eadk4027.
[7] Wang Q, Duan Y, Zan Z, et al. The Study of SRSF1 Regulates Abnormal Alternative Splicing of BCL2L11 and the Role in Refractory Acute Myeloid Leukemia. Chemotherapy.2024;69(4):224-236.
