一、标本的采集、处理与运输
用于病毒分离和鉴定的标本应在病程初期or急性期采集
保存：标本放入冻存液并<u>加入甘油or二甲基亚砜（DMSO）</u>、存放-70℃保存。
二、病毒的培养条件
<u>实验动物、鸡胚、体外培养的器官和细胞</u>
- 组织培养
组织培养用玻璃器皿用硫酸、重络酸钾溶液浸泡后再清洗应用
常用<u>MEM、RPMI1640</u>
<u>碳酸氢钠</u>→调节pH
<u>HEPES溶液</u>→pH缓冲能力
分散成单个细胞的化学制剂：胰蛋白酶、EDTA（Versen溶液）
EDTA作用原理：可以结合钙、镁离子、使组织细胞分散。
细胞生长液和细胞维持液主要区别：<u>血清含量不同</u>。
适宜pH 7.2~7.6、全过程关键→<u>防止污染</u>。 - 细胞株的保存
含10%二甲基亚砜的血清在液氮中保存细胞。 - 使用的细胞类型
原代细胞、二倍体细胞、传代细胞 三大类（根本区别：能否在体外无限传代） - 细胞的纯化
用细胞克隆技术、克隆：无性繁殖、遗传上相同的。
三、病毒病的常规实验室诊断
（一）病毒的分离和鉴定
病毒对细胞的感染性具严格的选择性和特异性，因此必须首先选择敏感细胞。
- 病毒增殖的判定
形态学和病理学变化 - 细胞病变（CPE）
表现为<u>严重的细胞破坏、细胞肿大、颗粒增多、细胞融合成-合胞体</u>or无明显的细胞变化
CPE常具有病毒“种”的特性--鉴定依据之一 - 病毒蚀斑（空斑）技术
单层细胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的<u>纯化or病毒含量的测定</u>。 - 病毒感染力的滴定
- 用实验动物测定LD50（半数致死量）
- 在组织细胞上测定TCID50（半数细胞培养物感染量）
- 病毒的保存：冷冻干燥-可长期保存
（二）病毒形态学检查
- 光学显微镜 仅用于大病毒颗粒<u>（如痘类病毒）和病毒包涵体</u>的检查
- 电子显微镜检查法
-
电镜直接检查法
标本粗提浓缩→磷钨酸盐负染→直接观察 -
免疫电镜检查法（更特异、更敏感）
病毒标本制成悬液→加入特异性抗体→病毒颗粒凝集成团→电镜观察、检测率↑ - 超过滤法
不同孔径火棉胶滤膜过滤病毒悬液→接种or血凝试验测定是否通过→估计病毒大小 - 超速离心法
病毒大小→沉降速度不同→测病毒的沉降系数（S）→计算病毒大小 - X线晶体衍射法
X线衍射图谱→数学处理→病毒结构亚单位&分子结构
标本必须为晶体、可研究<u>无包膜病毒</u>。
（三）免疫学鉴定
用已知的抗病毒血清or单克隆抗体→免疫-血清学试验→鉴定病毒的种类、型别
（四）病毒的分子生物学鉴定
分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性。
- 核酸测定 PCR、探针技术、核酸序列测定
- 蛋白质测定 免疫测定技术、电泳技术、质谱技术
