The EMBO Journal (2018)， IF=9.889（根哥）

背景介绍

研究小结

与细胞核染色质类似，线粒体基因组折叠并包装形成的球形特殊亚细胞器结构，称为线粒体类核（mitochondrial nucleoid）。线粒体类核是线粒体基因组储存、复制以及转录的重要场所，呈不连续的球状分布于线粒体基质中，单个线粒体常常包含有2-10个不等的类核。

Htr A2/Omi（High temperature requirement factor A 2,Htr A2）是一种进化保守的线粒体丝氨酸蛋白酶,由内质网合成,定位于线粒体膜间隙。

技术：

3D structured illumination microscopy

图像超分辨率Airyscan

IncuCyte FLR imaging

实验一

超分辨率气扫描共聚焦显微镜；A图，验证线粒体类核被包裹在线粒体中；B图，经过处理线粒体类核重新定位于线粒体外（绿色：TOM20；红色：DNA）

1）ABT-737抑制BCL-xL\BCL-2\BCL-w

2）ActD抑制MCL-1的转录

3）qVD是泛caspas抑制剂

1）和2）的连用可快速诱导细胞死亡；与3）连用可在短期内防止细胞死亡

通过缺失线粒体细胞色素c染色确定为发生了MOMP

定量分析mtDNA的释放

在MEF中看到mtDNA的释放

U2OS细胞WB验证敲除效果；敲掉了MOMP起作用的几个蛋白；其中BAX/BAK联合后才能抑制MOMP和细胞死亡（图G加了ABT-737和S63845处理）

SYTOX Green是一种可轻易穿过受损细胞质膜而不能透过活细胞质膜的绿色核酸染料，染死细胞。

只有BAX\BAK联合敲除后，线粒体DNA还在线粒体中

S63845是一种选择性的MCL-1抑制剂。对其他Bcl-2成员，如Bcl-2或Bcl-xL，没有明显结合能力。ABT-737抑制BCL-xL\BCL-2\BCL-w。

综上，基质中的mtDNA可在caspas抑制条件下，从线粒体中依靠BAK\BAX引起的MOMP而被释放。

实验二

SVEC cells；查看caspas抑制剂、ABT-737和S63845对细胞死亡的影响：ABT-737/S63845联合处理，细胞死亡更快，而caspas抑制剂（QVD-OPh）的加入则降低了细胞的死亡率

SVEC cells；明显看到经过处理的mtDNA不在线粒体中

SVEC cells；C：经ABT-737/S63845/QVD处理，IFN的相关基因表达量升高；D：尤其是caspas的抑制后，IFNB1显著升高；E：WB验证STING的敲除效果；G：WB验证BAK\BAX的敲除效果

Caspase不依赖性的细胞死亡（CICD）

敲除STING后，IFNB1的表达量降低，→表明STING影响CICD 期间的IFNB1的上调（之前有报道过）；敲除BAK/BAX后，IFNB1的表达量同样降低，→表明CICD需要MOMP作用

综上，mtDNA的释放和STING依赖的干扰素反应的激活之间的相关性。

实验三

mtDNA与TFAM蛋白的重定位

ABT-737/S63845/qVD-OPh目的是诱导CICD

JF646-MOM显示线粒体外膜

【活细胞录像的截图】观察单个线粒体

Omi 表示MOMP

观察外膜MOMP线粒体类核释放的作用

实验四

在CICD期间，mtDNA越过了内膜

B：Airyscan analysis；C：3D-Imaris-based analysis  →在MOMP之后，AIF和mtDNA在线粒体外膜外重新定位

在CICD期间，线粒体类核和线粒体外膜会从外膜中释放出来

综上，mtDNA在CICD期间，先与内膜挤压外膜，随后mtDNA再被释放到胞质

实验五

已报道：在MOMP过程中，GTPase DRP-1促进线粒体网络断裂和内膜重构

→构建Cre 重组酶条件性敲除的Drp1 MEF稳株

A/B：在MOMP作用期间，敲除Drp1后，mtDNA的变化不显著；C：敲除MCL-1的细胞再用CCCP处理，诱导大量线粒体裂变，再用药物诱导CICD→裂变对mtDNA释放的影响几乎没有

calcein信号随时间丢失

如果内膜变得具有渗透性，Co2+将自由地进入基质并淬灭位于基质的钙黄素（calcein），从而能够实时检测增加的渗透性。

CYPD促进MPTP，而F\G表明mTDNA的释放与CYPD无关

MPTP：线粒体通透性转换孔
综上，使mtDNA释放的MIMP独立于线粒体动力学和MPTP。

实验六

探究内膜如何破坏外膜，允许mtDNA释放

外膜孔径变大，TFAM由BAX修饰的孔中释放

MOM被激活的BAX点状结构修饰

67A识别活性BAX

活性BAX修饰内膜→ 线粒体内膜可以通过bax介导的外膜孔被挤压

AIF检测内膜