影响因子：11.1
研究概述：食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种致命的恶性肿瘤。免疫检查点抑制剂（ICIs）为ESCC患者带来了巨大的临床益处。作者旨在通过整合多种程序性细胞死亡（PCD）形式，构建一个预测预后和对ICIs反应的模型。收集与14种程序性细胞死亡相关的基因，生成多基因特征，包括凋亡、坏死、热凋亡、铁凋亡和杯状凋亡。Bulk和单细胞RNA转录组数据集被用于开发和验证该模型。作者通过Western印迹、共免疫沉淀（Co-IP）、LDH释放试验、CCK-8和迁移试验评估了ESCC细胞中两个坏死相关基因的功能，然后对ESCC患者样本（67人）进行了免疫组化（IHC）染色。作者构建的CCDI模型具有预测癌症预后和对ICIs反应的潜力。CCDI 模型中的 HOOK1 和 CUL4A 在 ESCC 中可能具有关键的调控作用，是 ESCC 的潜在治疗靶点和预后生物标志物。
本篇文章还可以进一步升级，例如基于13种细胞死亡模式的的评分进行分型，后续结合百种机器学习建模。或者将细胞死亡换成代谢等其他方向。
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研究流程：
首先，作者从已发表的文献和数据库中收集了14种细胞死亡形式的特征基因组，包括细胞凋亡（内在和外在）、内生性细胞死亡、坏死性细胞死亡、杯突性细胞死亡、氧化性细胞死亡、铁突性细胞死亡、碱突性细胞死亡、热突性细胞死亡、parthanatos、自噬依赖性细胞死亡、溶酶体依赖性细胞死亡、网状细胞死亡和ICD。研究流程图见图1a。
研究结果：
鉴定与14种细胞死亡形式相关的基因并建立预后特征基因组
作者使用单变量Cox回归从14种PCD共3518个基因中筛选出与OS显著相关的基因，然后利用多变量Cox回归生成每种细胞死亡形式的预后基因特征。图1b-o比较了正常组织和肿瘤组织中每个预后特征基因的表达水平，然后用匹配森林图总结了多变量Cox回归分析的结果。
评估14个预后模型和CCDI模型
作者绘制了14个预后模型随时间变化的ROC（图2a）。1年、2年、3年、4年和5年AUC>0.7的95%置信区间下限的预后模型被用于合并分析。在包含2-4个单独预后特征的各种组合模型中，将ICD（AUC=0.800）和坏死（AUC=0.803）结合起来的模型，即组合细胞死亡指数（CCDI），显示出最高的预测准确性（AUC=0.834）（图2b）。CCDI由16个基因组成（KIF11、MTOR、PIK3R1、TSC1、HOOK1、ALK、CEACAM1、VIM、CCND1、DPP4、NGFR、RPS24、MEFV、CLU4A、RARG和SRC）。随时间变化的ROC曲线见图2c。
Kaplan-Meier生存曲线（图2d）和UMAP降维（图2e）显示，与单独使用ICD或坏死模型相比，CCDI能更好地区分预后良好和预后不良的患者。此外，还绘制了精确度-召回曲线（PRC）（图2f）。坏死和ICD风险评分之间存在相关性，CCDI随着坏死和ICD风险评分的增加而增加（图2g）。最后，作者绘制了基因与ICD、坏死和CCDI模式的关联图。中心的深蓝色、绿色和红色斑点分别代表坏死、ICD和CCID模型，灰色线条连接相关基因（图2h）。线的粗细与每个基因的表达水平和相应预后模型的风险评分之间的相关性以及ICD、坏死和CCDI模型之间关于风险评分的相关性成正比（图2h）。同样，ROC曲线、Kaplan-Meier生存曲线和UMAP分析表明，在预测ESCC患者的预后方面，CCDI优于单纯的坏死或ICD模型。
CCDI界定的高风险组和低风险组的免疫治疗反应
为了探索CCDI模型对免疫治疗敏感性的预测能力，作者分析了CCDI模型风险评分与51个免疫检查点和调节因子之间的相关性。结果显示，CCDI与广泛的免疫相关基因显著相关，表明CCDI模型具有潜在的免疫意义（图3a）。在训练集（GSE53625）中应用TIDE算法预测对ICIs的反应，TIDE方法可以区分应答者（TIDE评分<0）和非应答者（TIDE评分>0）（图3b）。皮尔逊相关分析表明，风险评分与TIDE评分呈正相关，这意味着CCDI分值低的患者比CCDI分值高的患者更有可能对ICIs产生反应（图3c）。事实上，在同一队列中，低风险组的应答者比例高于高风险组（图3d）。
作者通过IMvigor210数据集进一步证实了CCDI预测ICIs反应的能力。根据多变量Cox回归分析系数和CCDI基因的表达，计算出IMvigor210数据集中每位患者的CCDI评分。CCDI评分大于0.64（早期生存分析中为训练集设定的临界值）的患者被归入高风险组，其余患者被归入低风险组。Kaplan-Meier分析显示，与高CCDI患者相比，低CCDI患者的生存期明显延长（图3e）。作者发现低风险组达到CR或PR的患者比例高于CCDI定义的高风险组（图3f）。此外，CR或PR组患者的平均CCDI低于PD组患者（图3g）。作者还在GSE78220队列中验证了CCDI对接受抗PD-1疗法（pembrolizumab和nivolumab）治疗的黑色素瘤患者的预测价值。与高风险组相比，低风险组中对抗击PD-1疗法有反应的患者相对较多（图3h和i）。同样，就肾细胞癌而言，作者观察到CCDI低的患者更有可能从抗PD-1治疗中获益，而有反应者（GSE67501）的CCDI更低（图3j和k）。综上所述，这些结果表明，低风险患者对ICIs更为敏感，这意味着CCDI可能可以预测不同类型癌症对ICIs的敏感性。
利用单细胞RNA转录组建立ESCC细胞图谱
作者利用已发表的单细胞转录组数据（GSE196756）进一步分析了CCDI基因的重要性。经过多重质量控制和过滤步骤，作者从36,515个单细胞中获得了包含24,171个基因的表达矩阵。利用典型的单个标记基因，作者将所有细胞分为八大细胞类型，包括上皮细胞（上皮细胞和ESCC细胞）、免疫细胞（T细胞、B细胞、单核细胞和树突状细胞）、基质细胞（成纤维细胞和内皮细胞）和红细胞（图4a和b）。在配对的正常组织和肿瘤组织中，上皮细胞、免疫细胞和基质细胞的比例差异很大（图4c）。
接下来，细胞间通讯分析结果显示，ESCC细胞与免疫细胞和基质细胞有重要的相互作用（图4d和e）。利用Cell Chat算法，作者推算了TME中不同类型细胞的传入和传出信号。作为信号发送者，各种细胞都能合成和分泌各种细胞因子或配体；同时，作为信号接收者，它们还能通过受体感知细胞外配体。图4f展示了不同类型细胞间沟通的关键信号。总之，TME中不同类型细胞间配体与受体的相互作用凸显了各细胞亚群对肿瘤发生发展的重要性。
识别细胞状态转变过程中的动态CCDI基因
接下来，通过对GSE196756数据集的进行拟时序分析，作者试图研究CCDI基因是否有助于浸润免疫细胞、基质细胞和ESCC细胞的发育轨迹。首先，使用"singleR"包和已发表研究中收集的标记基因将七个细胞群划分为不同的子集（图5a-g上部）。作者使用"Monocle2"包根据细胞亚型对原始组内的细胞进行排序，以确定它们的单细胞运动轨迹。每个细胞群的时间线轨迹起点用箭头表示（图5a-g中部）。作者发现，PIK3R1、RPS24和VIM的水平随着T细胞的分化过程而动态变化（图5b下部），这表明这些基因可能与这些细胞的命运决定有某种关系。总之，作者发现RPS24和VIM无论如何都可能调控所有分析细胞群的细胞状态。此外，细胞周期蛋白D1（CCND1）也可能在成纤维细胞和内皮细胞的动态转变过程中发挥特殊作用（图5e和f）。作者还注意到，CUL4A与ESCC细胞的分化过程有关（图5g）。
接下来，作者获得了ESCC的TCR-seq数据集（GSE188900）对T细胞进行进一步分析，该数据集包含从52,772个单细胞中检索到的23,160个基因的表达矩阵，证实了RPS24、VIM和PIK3R1在细胞命运决策中的重要性（图6）。对此数据集的分析表明，除了CUL4A外，HOOK1也可能对ESCC细胞的转化至关重要（图6g）
HOOK1和CUL4A的体外功能分析
鉴于HOOK1和CUL4A在ESCC预后中的功能意义以及生物信息学分析所揭示的对肿瘤细胞命运的调控，作者研究了HOOK1和CUL4A的体外功能。作者检测了HOOK1和CUL4A在食管上皮细胞和ESCC细胞系中的表达水平。HOOK1和CUL4A水平相对较低的KYSE150和KYSE410细胞被用于功能增益分析（图7a）。作者进行了RT-qPCR（图7b，上图）和Western印迹（图7b，下图）检测，以确认基因操作的效率。接下来，作者证明顺铂可诱导ESCC细胞坏死（图7c），并将其用作坏死诱导剂。HOOK1的异位表达诱导ESCC细胞坏死，表现为RIPK1、p-RIPK3和p-MLKL水平的升高，而几种坏死抑制剂，如necrostain-1（Nec-1）、强效抗MLKL药物新磺酰胺（NSA）和更特异的抗pRIPK1药物RIPA-56都能以浓度依赖性的方式减弱坏死（图7d-f）。
坏死的标志是形成由RIPK1和RIPK3组成的复合物--坏死体，以及MLKL的招募和磷酸化。作者的Co-IP结果表明，强化表达HOOK1会促进RIPK1、RIPK3和MLKL的相互作用，这表明ESCC细胞中的坏死体复合物增加了（图7g）。此外，过表达CUL4A可减少坏死体的形成（图7h）。这些数据进一步证实了HOOK1和CUL4A促进和减少了ESCC细胞的坏死。LDH检测证实，HOOK1过表达介导的细胞损伤可被Nec-1、NSA和RIPA-56逆转（图7i-k），而CUL4A过表达可显著减少顺铂诱导的ESCC细胞坏死（图7l），这表明这两个基因调控坏死。此外，作者还研究了HOOK1和CUL4A对ESCC细胞增殖和迁移的影响。通过CCK、跨孔迁移和伤口愈合实验，强制表达HOOK1抑制了ESCC细胞的增殖和迁移（图7m,o,q），而CUL4A则对癌细胞产生了相反的影响（图7n,p,r）。这些结果揭示了HOOK1和CUL4A在ESCC细胞中分别通过调控癌细胞坏死、增殖和迁移而抑制和促进肿瘤的潜能。
临床样本中CUL4A和HOOK1的验证
此外，作者还验证了这两个基因在ESCC患者样本中的表达。Western印迹结果显示，与12例患者的匹配肿瘤组织相比，HOOK1在瘤周组织中高表达。与此同时，CUL4A的表达呈反向趋势，表明该基因具有促进肿瘤生长的潜能（图8a）。作者还对67例ESCC患者的肿瘤组织和10例肿瘤周围组织进行了免疫组化（IHC）染色（图8b和c）。结果发现，HOOK1主要定位于上皮细胞的胞浆中，而在瘤周组织中则下调（图8b、d）。
此外，与高分化肿瘤相比，低/中分化肿瘤的HOOK1表达水平进一步降低（图8e），且与临床分期无关（图8f）。CUL4A存在于上皮细胞的细胞核和细胞质中，并在肿瘤组织中上调（图8c，h）。CUL4A与ESCC的分化程度和临床分期无关（图8i和j）。此外，ESCC患者的HOOK1或CUL4A表达水平被二分。Kaplan-Meier生存率分析表明，HOOK高表达肿瘤患者的生存率明显优于HOOK低表达肿瘤患者（图8g）。
相比之下，CUL4A高表达患者的预后比基因低表达患者差（图8k）。综合分析表明，HOOK低/CUL4A高表达的ESCC患者的OS最差（图8l）。单变量和多变量COX回归分析确定HOOK1（图8m）是ESCC预后的独立预测因子。总之，这些结果再次证实了HOOK1和CUL4A在ESCC的发展中起着至关重要的作用。
研究总结：
作者结合免疫原性细胞死亡（ICD）和坏死标志，建立并验证了16个基因的预后联合细胞死亡指数（CCDI）。正如肿瘤免疫功能紊乱和排斥（TIDE）分析所显示的那样，CCDI还能预测癌症患者对ICIs的反应，并在四项独立的ICI临床试验中得到证实。轨迹分析显示，HOOK1和CUL4A可能会影响ESCC细胞的命运。作者发现，HOOK1诱导坏死，抑制ESCC细胞的增殖和迁移，而CUL4A则表现出相反的作用。Co-IP分析证实，HOOK1和CUL4A促进和减少了ESCC细胞中坏死体的形成。来自ESCC患者的数据进一步证实，HOOK1和CUL4A可能分别是肿瘤抑制因子和致癌基因。
