1. INO80 Correlates With Heart Development and HF
为了探究INO80 complex在心脏中的作用，作者首先检测了它在心脏成熟过程中的表达，结果显示心脏中INO80的表达在出生后持续增加(a-c)。而且Ino80在心肌细胞中的表达显著高于非心肌，提示其在心脏成熟过程中可能发挥着作用(d)。为了探究INO80和心衰的关系，作者在TAC小鼠模型中检测了Ino80的表达，发现存在显著上调。而且主要是在衰竭心脏的心肌细胞表达(e-i)。在心衰患者心脏中也存在着一致的效应(j-n)。
Collectively, these findings suggest that the INO80 complex may play a role in dictating cardiomyocyte fate in normal development and HF.
2. Ectopic Expression of Ino80 in Cardiomyocytes Leads to HF With Reduced Ejection Fraction
随后作者构建了tamoxifen诱导的心肌特异性Ino80过表达小鼠(a-c)。Ino80-OE小鼠的存活率显著下降，在d20时，存活率仅为13%(d)。超声结果显示Ino80-OE小鼠存在快速的EF值下降，在D4下降了48%，而在D6时EF仅为21%(e)。小鼠的心重体重比也显著增加(f)。HE结果显示Ino80-OE小鼠心脏大小显著增加(g)，WGA染色显示细胞大小显著增大(h-i)。此外，Ino80的过表达使得心肌细胞高表达了多种心脏肥大和HF基因，包括Nppa, Nppb, Myh7, Tnni1, Mki67, 和 Aurkb。
Together, these results suggest a rapid induction of HF by Ino80 overexpression, possibly by promoting uncontrolled cardiomyocyte hypertrophy.
3. Ino80 Overexpression in Cardiomyocytes Recapitulates Molecular Features in HF
随后作者在Ino80诱导表达后的D0, D2, D4 和 D6 进行了RNAseq。结果显示随着时间进展，心脏的转录越来越偏离正常心脏。随后作者对DEG进行了聚类分析，以观测INO80-induced HF的基因表达模式，结果显示存在4个模块(a)。C1的基因一直到四天都在上升，随后下降，主要与DNA replication 和 cell cycle progression相关。C2的基因沿着时间表达逐渐下降，其功能主要与cardiac energy production相关。C3的基因在d2达到峰值，随后下降，主要与muscle contraction等相关，可能属于心脏早期代偿反应。C4的基因则随着时间表达增加，其功能主要与纤维化和炎症相关(b, c)。Energy collapse 和炎症的发生以及细胞外基质随时间的沉积非常显著(d)。在电镜下，D2时心肌细胞出现了存在线粒体肿胀、线粒体嵴断裂、线粒体自噬。而在D4，大多数心肌细胞都出现了嵴受损和基质肿胀(e)。These observations also implied an initial adaptive response to engulf damaged mitochondria, which finally yielded to persistent injury. 此外，CD68+巨噬细胞的浸润、心脏纤维化和细胞外基质沉积都增加(3f, g, supS3F-3H)。
Taken together, these cellular and molecular data indicate that Ino80 overexpression induced an HF phenotype in mice.
为了探究Ino80过表达引起的疾病表型与HF的相似度，作者使用了HF患者心脏RNAseq数据的DEG，Ino80过表达的心肌和cardiomyocytes in other contexts，进行了皮尔森聚类。结果显示Ino80-OE与HCM聚在一起(h)。此外，D6 Ino80过表达的心肌的高表达基因与HCM-HF显著富集，下调基因则呈相反的富集。
Together, these observations provide strong evidence that ectopic expression of Ino80 in cardiomyocytes leads to hypertrophy-induced HF.
4. Ectopic Expression of Ino80 Leads to Remodeling of Transcription Regulatory Networks Important for Cardiac Function
在INO80调节的众多基因中，作者想要去寻找哪些基因在Ino80过表达时更快的发生了变化并探究其是否形成了调控网络以更好的调节生物学过程。
因此作者对诱导Ino80过表达后days 0, 1, 2, 3的小鼠心脏心肌细胞进行了单细胞测序(a)，一共得到了3364个细胞，基因中位数为3523(b)。Ino80在诱导后表达显著升高(c)。使用HF index references (generated from either human or mouse data)，作者计算了其与各个心肌细胞Ino80表达的相关性，发现呈显著正相关(d)。随后作者进行了拟时序分析。结果显示D1和D2的心肌沿着时间轴排列而D3心肌则排列在末尾，提示其处于established state(Fig S5E, F)。为了探究Ino80高表达下反应最迅速的基因，作者对D0, D1心肌进行了拟时序分析(e, f)。D1心肌的Ino80呈差异性表达(f)。随后，作者根据Ino80的表达将细胞进行排序，得到了3个D0和D1的DEG基因表达模式(g)。C1主要与线粒体代谢和肌纤维装配有关，这些基因的表达与Ino80的表达负相关(g,h)。C2的基因主要参与应对外界刺激反应，并参与血管生成和炎症。C3的基因主要与肌肉发育和适应有关，且主要在Ino80接近表达峰值时表达，提示分子和细胞水平HF的建立(g,h)。These apparent patterns of gene expression changes led us to hypothesize that INO80 may control the expression of a set of regulatory factors important for cardiac function, thereby amplifying its impacts on cardiac function through the downstream tar- gets of these factors.
为了验证前面的假设，作者计算了Ino80表达增加下的regulons活性，Regulon同样存在3个模块(i)。Mef2 family- regulated modules，如Ezh2和Foxn3模块，与Ino80表达负相关。此前有文献报道过，Mef2 family TFs (Mef2a-d)在心脏发育和疾病中起到重要作用，如促进心肌细胞的存活。这些结果提示异常增加的Ino80表达引起了Mef2-centric 网络的失活，引起心肌细胞死亡。此外，AP-1家族分子Jun 和 Junb, Klf4, Cebpb, Myc, Runx3, Egr1, Maf 和 Rela, 则与C2模块类似。此前有文献报道过Jun家族的转录因子与心脏失代偿有关。在最后一个模块中，一些与新功能失代偿的regulons 包括Foxo1, Jund 和 Sox5，随着Ino80的高表达显著激活(i)。同样的，大多数调控模块中的下游靶基因都和它们上游的regulons一样存在着类似的与Ino80表达的相关性 (j)。UMAP图上的The centered positions of the regulatory modules, calculated on the basis of their activities in each cell, 同样存在类似的趋势(k)。值得注意的是，许多regulon的功能，尤其是 Mef2 家族，其活性在 Ino80 过表达时降低，且其功能主要与肌肉细胞发育和肌节结构相关，而那些与 Ino80 表达水平正相关的regulon更强的富集到细胞因子产生和炎症反应(l)。
Taken together, these results suggest that increased Ino80 expression leads to remodeling of transcription regulatory networks to disrupt normal cardiac function and to raise global inflammation level.
5. Alteration of INO80 Occupancy on Target Genes Underlies Remodeling of Transcriptional Regulatory Networks
接着，作者分离了对照和Ino80-OE心脏的心肌细胞，进行了ChIP-seq检测来确定INO80的直接下游靶点。尽管约24%的peaks位于promoter区，大多数的INO80 peaks位于内含子区 (42.19% in control, 43.24% in Ino80 OE)和基因间区 (23.05% in control, 22.07% in Ino80 OE)。作者联合了Sham和TAC组小鼠心脏的Chip数据进行了分析。结果显示Ino80过表达组和TAC鼠共有204和730个基因显示出INO80 occupancy的增强或下降(a, b)。增强或下降的两个基因集都富集到了与心脏发育和病理过程的基因集，提示 INO80对心肌细胞的命运和功能有着 overarching control (c, d)。此外，增强的204个基因与人HF显著富集，而下降的730个基因与人Normal样本更显著富集，提示INO80的作用具有物种保守性(e, f)。更进一步，作者将TFs with altered INO80 occupancy 和前面第四部分中Ino80过表达后活性发生变化的123个regulons取了交集，得到79个TF。提示 INO80 直接调节 a core set of 79 regulators, 包括 Mef2a, Mef2c, Gata4, Pbx1, Klf4, Atf3, etc, 这些转录因子可能组成了心脏功能调节的核心调控网络 (g)。这79个TF也显著富集到了心脏功能相关通路，如肌组织发育和心脏生长(h)。交集也得到了2623个下游靶基因，这些靶基因也富集到了心脏功能相关通路(i, j)。随后作者将OE的ChIP，TAC的ChIP和单细胞数据三者取了交集，得到26个结合增加的TF，作者用ChIP-qPCR进行了验证(k-m)。
6. Ino80 Overexpression Reshapes Chromatin Accessibility to Remodel Transcriptional Regulatory Networks
INO80 occupancy 的显著变化使得作者想要去探究染色质结构。因此作者又做了ATAC-seq。分组依然是Ctrl和Ino80-OE (a)(参考：ATACseq和ChIPseq)。作者鉴定出了3种染色质可以性变化pattern。未变化的有7271基因，占57.3%。上调的有504基因，占4%，下调的有4916基因，占38.7% (a)。上调和下调的基因都富集到了细胞成熟等、稳态调节等通路(b)。随后作者将Chip-seq的数据与ATAC-seq的数据取了交集，探究INO80对染色质可及性的直接影响。与预期一致，在Ino80过表达下显示存在增强的INO80 occupancy的基因，其染色质可及性增强，反之亦然(c-e)。与此一致，INO80结合下降的regulators在Ino80过表达下显示出下降的Ino80可及性，反之亦然(f)。Representative ChIP followed by high-throughput sequencing, ATAC-seq, and RNA- seq genomic tracks of some of these genes, including Sox17, Mef2c, Nppb, and Irf2, demonstrated the con- cordance among INO80 binding, chromatin accessibil- ity, and gene expression(g)。
Together, these findings suggest that perturbation of genome-wide INO80 binding reshapes the chromatin accessibility landscape to reinstruct transcription of genes for cardiac function.
7. MEF2A Facilitates Recruitment of the INO80 Complex to Downstream Target Genes
接着，作者整合了ChIP，ATAC和单细胞的数据，取交集得到47个上调的T/regulon和其下游的870个靶基因 (a, b)。其功能与心脏功能显著相关(c)。随后作者使用了ATAC的数据以探究870个靶基因的common DNA binding motif，得到了存在于47个TF中的10个TF (d)。由于这10个TF受INO80调控，作者假设这些关键TFs不仅是INO80的下有靶点，而且可以作为INO80的DNA-bound partner从而形成一个调控网络以影响INO80的基因表达。由于Mef2a的表达显著下降(e)，作者以MEF2A为例来验证这个假设。与这个模型一致，the signal intensity of INO80 occupancy on genes with predicted MEF2A binding motifs was significantly higher than those without (f, g)。为了验证MEF2A在INO80 binding中的作用，作者使用了慢病毒shRNA并观测到了显著下降的INO80在靶基因上的occupancy(h, i)。因此, Mef2a 不仅是INO80过表达而表达抑制的靶基因，其同样介导了INO80对吧基因的调控，这些结果支持了这样的模型：INO80 coordinates a core set of effector TFs, including Mef2a, to form regulatory networks controlling the expression of genes that are important for cardiac function.
8. INO80 Depletion in Cardiomyocytes Retards the Progression of HF
最后，作者探究了抑制INO80的表达是否可以作为HF治疗的可行方法。做噢着构建了心肌细胞特异性敲除的 Ino80-cKO 小鼠，并在TAC术后3w使用tamoxifen敲除了心肌细胞的Ino80 (a)。结果显示敲除小鼠心功能显著改善(b-e)，心脏扩张和纤维化都显著改善(f-i)。心重体重比下降(j)，心衰标志物的表达也显著下降(k)。Together, these data imply the potential benefit of repressing INO80 to prevent a decline in cardiac function.
思考：
- 这篇文章测了好多数据啊
Fig 3: Ino80-OE Ctrl, D2, D4, D6的RNAseq
Fig 4: Ino80-OE D0, D1, D2, D3的心肌单细胞
Fig 5: Ctrl, Ino80-OE, Sham, Tac, 这四组心脏的ChIPseq
Fig 6: Ctrl, Ino80-OE的ATAC-seq
(ChIP和ATAC没看到送的是什么时间点的，是心肌还是组织) 把这么多数据分析清楚理出思路真不容易啊 - 有几个图画的很有意思。比如Fig 3的A图和B图，多组RNAseq这样展示简单明了。还有Fig 4的G和I，这样展示的思路很好。
- 感觉自己还是数据解读和讲故事的能力差了点。如果是我来排Fig的话，Fig5里我可能直接上来就排K图了，不会放前面两两交集的结果。Fig6也可能整个就被我放附件去了。而且已经确定转录因子+有ChIP的结果的情况下，我可能也想不到再去送个ATAC。
