不要看说了什么，要看做了什么
有时会将上下游进行分析，有时结合转录组分析将整个代谢机制整理
ZMRR1编码区存在有变异让玉米存在耐寒性
a-c、两周培养的幼苗（25度）放在4度培养4d恢复两天看到的表型；经过对突变体
d-f、低温条件下zmrr1突变体(c1和c2)的冷表型(d)、损伤面积(e)和离子泄漏(f），从图中可以看出来，在进行低温处理之后，突变体没有那么耐低温
g、10日龄放在25度和4度培养指定时间，对ZmRR1基因进行抗体检测，HSP82为对照处理，可以从图中看到，在4度培养时间达到3h，可以诱导ZmPP1进行表达且越来越明显，而在25度环境中可以看出来基因强度越来越弱，只有冷环境才可以诱导这个基因的表达，作为对照的HSP82（在低温和正常温度都会表达）的含量可以一直保持不变
h、进行关联分析，并且对这个基因缺失部分Indel35，进行两个LD block作图，根据ZmRR1（INdel35）显著变异的单倍型进行分组，黑点说明了这个基因编码区域的非同义突变。
i、HapA这个单倍型有15个品种，损伤区域明显小于146个品种的HapB单倍型
j、用免疫印迹分析看到两个不同的单倍型的蛋白量不同，HapB的蛋白量更低一些，HapA比较轻
k、经过磷酸酶处理和不经磷酸酶处理，玉米原生质体中表达HF-ZmRR1HapB的ZmRR1蛋白用抗HA进行检测，HSP82作为对照进行处理
ZmMPK8在体内外均与ZmRR1相互作用，在体内和体外的实验均显示这样结果B结合结合能力强于A的结合能力
a、酵母杂交系统，有BD和AD，DBD是DNA结合结构域，AD是激活结构域，并且在ZmRR1的浓度上面逐渐增加，可以看到圆点结合会更多，并做了LDHA分析，发现浓度越强，结果越弱，
b、可以看到两个单倍型的区别在于是否有15个氨基酸的差别，两者的相互作用，从上面两张图可以看出来，ZmMPK8的全长，氮端结构域，和KD区域，ZmMPK8和ZmMPK2都可以引起玉米的冷反应缺陷，重点关注了ZmMPK8发现不可以和N段有相互作用，可以和KD端有相互作用
c、做了双分子荧光互补实验，将两者放入培养皿中，黑暗处理15个小时，用共聚焦显微镜观察结果，显示了ZmMPK8的N端没有与基因ZmMPK8相互作用，从上面一层图可以看出ZmMPK8定位于原生质体的胞质中，ZmMPK8这个蛋白在细胞质或者细胞核中都存在
d、我们进行了谷胱肝泰转移酶下拉实验，从实验中可以看出两个蛋白之间的相互作用，将大肠杆菌表达纯化的两种单倍型与GST蛋白结合，然后看这两个蛋白与ZmMPK8的孵育，结果发现蛋白HapB结合要比HapA结合多一些；结果表明了ZmMPK8与HapB亲和力要高于HapA蛋白；怎么看出来蛋白B要比蛋白A结合力度强？
e、一共存在三种物质，两种单倍型用GFP进行标记，用抗GFP进行检测两种蛋白是否存在，用MYC标记ZmMPK8，并且用抗MYC检测ZmMPK8蛋白，从结果看来，最后一行的结果看来Anti-MYC的量看来，和B型结合的能力要比和A结合能力强到2倍以上；
ZmMPK8蛋白负调控耐寒性过程
a、为了探索ZmMPK8蛋白在玉米耐寒性中的作用，可以看出来在控制组中表现一致，在低温处理中，结果显示，过表达ZmMPK8蛋白出现了植物耐寒性没有那么强；耐寒性降低，OE11&13是泛素启动子驱动过表达ZmMPK8过表达株系；经过冷处理
的转基因株系，同样在过表达ZmMPK2时，也体现了植株的耐寒性降低，反应了ZmMPK2和ZmMpk8具有相似的功能
b、将ZmMPK8基因进行突变，发现control植物的耐寒性没有突变的耐寒性好，其中一个突变体c1在起始密码子（ATG）下游306bp插入1bp，c2在起始密码子后面299和309之间缺失11bp，导致了102和109氨基酸后面移码和翻译提早终止，说明这个基因属于负调控
c、为了解读ZmRR1和ZmMPK8基因的遗传相关性，通过zmrr1-c1与zmmpk-c1杂交形成双突变，观察相关的耐寒性可以看出有比单突变更好的效果，对于离子的渗透性方面，可以看出来没有zmmpk-c1的表型强大，说明了zmmpk通过和基因zmmrr1互作来影响耐寒性；zmmpk通过负调控基因zmmrr1来调节耐寒性
ZmMPK8介导ZmRR1的磷酸化和降解
背景：通过分析ZmRR1HapA和ZmRR1HapB中最高度相关序列发现Indel5有个保守丝氨酸-脯氨酸基序，预计是一个潜在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸基序
a、zmrr1可能是zmmpk8的底物，为了验证这一假设，进行了体外磷酸化分析，通过对ZmMPK8与其同源物AtMPK4序列分析，鉴定出了tyr113是自激酶活性的重要残基，生成了纯化his标记的zmmpk-y113c和zmmpk8蛋白，并使用zmmrr1Hap1作为底物对它们进行体外磷酸化分析，结果发现zmmpk8-y113c表现出很强的自磷酸化，zmmpk8也会出现磷酸化，但磷酸化轻度没有zmmpk8-y113c强，此外，两者均可以磷酸化基因zmrr1-hapB，为了在ZmRR1HapB中寻找潜在的ZmMPK8磷酸化位点，通过液相色谱-ZmMPK8磷酸化的GST-ZmRR1质谱MS/GST-ZMPR1HapB重组蛋白，确定了Ser15为GSTZmRR1的候选磷酸化位点，当这个位点突变为Ala；说明了相互都存在一个磷酸化位点，在ZmRR1Ser15，在ZmMPK8-tyr113位置，一旦两个中的一个发生了突变，这个相互作用就会受到影响，进而影响到耐寒性；
b、HF-ZmRR1HapB与ZmMPK8-MYC在本氏链球菌叶中共表达的免疫印迹分析，为了确定在植物当中这两个蛋白可以相互作用，可以看到没有共表达ZmMPK8-MYC时，只有两条带，当共表达了ZmMPK8时可以看出来上带的磷酸化形式变得更强了
c、zmmrr1没有突变，突变发生在zmmpk上面，可以发现检测到的量远小于野生型的量，说明了zmmpk参与了磷酸化的过程
d、虽然会发生一定的磷酸化，但是zmmpk8突变体这种磷酸化强度要弱，说明了还有别的蛋白质磷酸化了基因zmmr1，过表达zmmpk8则会有更强的磷酸化强度
e、当我们在玉米原生质体中表达ZmRR1S15A-GFP时，只检测到非磷酸化带（低带），这模拟了ZmRR1HapA的情况（图1j）。这些结果表明，ZmRR1HapB的Ser15是ZmMPK8的磷酸化位点，而在ZmRR1HapA中缺失
f ZmMPK8加速了冷胁迫下ZmRR1HapB的降解
f、免疫印迹分析野生型、ZmMPK8-OE和zmmpk8-c1植株中ZmRR1HapB蛋白水平。10日龄幼苗在4°C下培养至指定时间。用抗ZmRR1抗体检测ZmRR1；为了分析ZmMPK8磷酸化ZmRR1HapB的生物学意义，我们使用抗ZmRR1抗体的免疫印迹法检测了野生型、ZmMPK8-OE和zmmpk8-c1植株中ZmRR1HapB的蛋白丰度。与野生型相比，zmmpk8过表达植株中ZmRR1HapB蛋白水平的增加略有减弱，但在zmmpk8-c1突变体中显著增加
g、在玉米原生质体中用不同数量的ZmMPK8-MYC瞬时表达ZmRR1HapB-GFP后，ZmRR1HapB蛋白水平随着ZmMPK8水平的增加而显著降低（图4g）。26 S蛋白酶体抑制剂MG132的处理完全抑制了ZmRR1HapB蛋白丰度的下降
h、用无细胞蛋白降解法检测ZmMPK8-OE和zmmpk8-c1植株中ZmRR1HapB的降解情况。我们从大肠杆菌中表达并纯化重组GSTZmRR1HapB，并将其与从野生型、zmmpk8过表达和zmmpk8-c1玉米幼苗中提取的等量总蛋白一起孵育。在与ATP孵育指定时间后，GST-ZmRR1HapB在野生型蛋白存在的情况下逐渐降解
i、ZmRR1HapB受到26 S蛋白酶修饰降解的观点。为了研究ZmRR1HapB在Ser15位点的磷酸化是否影响其稳定性，我们将GSTZmRR1HapB或GST-ZmRR1S15A与来自ZmMPK8-OE植物的总蛋白孵育。GST-ZmRR1S15A的降解速度比GST-ZmRR1HapB要慢得多。综上所述，ZmMPK8表明ZmMPK8磷酸化ZmRR1HapB，促进低温胁迫下其泛素介导的降解。
a、火山图显示了ZmRR1在25和4°C时调控的差异表达基因（DEGs）的数量。以P值< 0.05和绝对log2倍变化>1为标准，鉴定DEGs；火山图显示了ZmRR1在25和4°C时调控的差异表达基因（DEGs）的数量。以P值< 0.05和绝对log2倍变化>1为标准，鉴定DEGs，利用RNA-seq数据，我们分析了野生型和野生型之间的差异表达基因（即zmrr1调控的基因）。ZmRR1-OE植株与允许条件下（25°C）或冷处理下（4°C）相比，ZmRR1-OE的>2和P < 0.05。在25°C时，与野生型相比，我们在ZmRR1-OE中鉴定出588个上调基因（zmRR1激活基因）和455个下调基因（zmRR1抑制基因）
b、共鉴定出1727个基因为zmrr1调控基因（图5b）。基因本体论（GO）术语分析显示，这些受zmrr1调控的基因显著富集为10个基因（http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/）（补充数据4）。单个簇的功能注释与蛋白质磷酸化（簇1）、水解酶活性（簇2）、氧化还原（簇4）、纤维素和细胞壁代谢过程（簇7和8）相关
c、显示受ZmRR1调控的DE转录因子和细胞壁生物发生相关基因的热图。颜色表示相对表达式的log2倍变化，根据定义的冷反应转录组43,1727个ZmRR1取代的基因中有多达803个基因被冷处理显著改变，称为ZmRR1取代的COR基因；已经鉴定出一组编码COR基因关键转录激活因子的ZmDREB1家族基因（图5c；补充图10b），表明ZmRR1至少部分通过ZmDREB1依赖的信号通路调控玉米的低温耐受性。在已鉴定的zmrr1调控基因中，与细胞壁生物合成基因相关的基因（聚类7和簇8）富集最强（图5b）。有趣的是，这些基因在ZmRR1-OE幼苗中的表达显著增加，特别是在冷处理后（图5c）。对这些基因的详细功能分析显示，一组几丁质酶类蛋白（CTL）和纤维素合酶A（CesA）家族基因的强烈富集，因此，ZmDREB1和细胞壁相关基因可能有助于增强过表达ZmRR1的转基因玉米的耐寒性。
ZmRR1通过调节Zmdreb1和ZmCesAs的表达来调控耐寒性
a-d、10日龄野生型、ZmRR1-OE (a) zmrr1突变体(b)、ZmMPK8-OE (c)和zmmpk8植株(d)在4°C冷处理12 h后，ZmDREB1.10和ZmCesA2的相对表达水平。
a、ZmRR1通过调节Zmdreb1和ZmCesAs的表达来调控耐寒性。为了确定ZmDREB1和ZmCesA家族基因在野生型和ZmRR1-OE植株之间的表达变化，我们在时间过程冷处理下进行了实时荧光定量PCR分析（补充图11a）。结果表明，冷诱导的ZmRR1-OE植株中ZmDREB1.7、ZmDREB1.10、ZmCesA2、ZmCesA10和ZmCesA11的上调均显著高于野生型
b、相比之下，与野生型植物相比，zmrr1中冷诱导的zmdreb1和ZmCesAs的上调被显著抑制
c、考虑到ZmMPK8负调控ZmRR1的稳定性，我们检测了ZmDREB1s和ZmCesAs在ZmMPK8-OE和ZmMPK8中的表达。冷诱导的ZmDREB1s和ZmCesAs的表达在ZmMPK8- OE中显著降低，但在zmmpk8中显著高于野生型（图6c，d；补充图11d，e）。这些结果表明，在低温胁迫下，ZmDREB1和ZmCesAs的表达受ZmRR1正调控，而ZmMPK8负调控。
e-h、为了研究ZmMPK8-和Zmrr1调控的ZmDREB1和ZmCesA基因的表达是否与玉米的耐寒性有关，我们建立了过表达ZmDREB1.10和ZmCesA2的转基因株系，并对两个独立的株系进行了耐寒性试验。与预期的一样，与野生型相比，ZmDREB1.10-OE线的相对损伤面积和离子泄漏量减少
i-I、这些结果表明，DREB1在增强玉米植株耐寒性方面的功能是高度保守的。zmcesa编码纤维素合酶44的催化亚基。我们观察到，两种ZmCesA2-OE独立的转基因株系均表现出耐寒表型，与野生型相比，相对损伤面积和离子泄漏均减少（图6i-l）。这些数据表明，ZmCesA2在玉米的耐寒性中起着积极的作用。
提出的zmrr1介导的耐寒性模型
在低温胁迫下，ZmRR1蛋白的积累以增强其耐寒性。ZmMAPK8在低温胁迫下与ZmRR1HapB的Ser15位点相互作用并磷酸化，以促进其泛素介导的降解。ZmRR1HapA缺失45 bp，阻止了ZmMPK8的降解，导致ZmRR1HapA的丰度更高。结果表明，HapA玉米自交系增加了ZmDREB1和ZmCesA基因的表达，从而提高了玉米的耐寒性。HapB
在低温胁迫下，ZmRR1积累并诱导Zmdreb1和ZmCesAs的表达，从而提高其耐寒性。ZmRR1被冷激活的ZmMPK8在Ser15位点磷酸化，这促进了泛素介导的ZmRR1的降解。由于ZmMPK8磷酸化位点的缺失，提高了ZmRR1等位基因ZmRR1蛋白的稳定性，为耐寒作物的育种提供了新的策略。
怎么有人不做分子验证？来揭示大自然的规律？
玉米是低温敏感物种，经常面临低温胁迫，对生长和繁殖产生不利影响。本研究表明，zmrr1基因自然变异导致了玉米自交系间耐寒性的差异，ZmRR1的InDel-35编码一种含有丝裂原活化蛋白激酶（MPK）磷酸化残基的蛋白，与低温耐受性密切相关。ZmMPK8是一种低温耐受性负调控因子，它与ZmRR1的Ser15位点相互作用并磷酸化，负调控耐寒性，所以想要让玉米有抗寒性，需要对很核心位点突变，对ZmRR1中含有Ser15的45bp区域缺失，阻止了ZmMPK8的磷酸化，通过26S蛋白酶体途径抑制其降解，来增强植物对寒冷的耐受性，转录组分析结果显示，ZmRR1正向调控ZmDREB1和纤维素合成（CesA）基因的表达，由于增强了细胞壁的
所以在低温胁迫下，ZmRR1蛋白积累可以增强其耐寒性。ZmMAPK8与ZmRR1相互作用会将ZmRR1蛋白降解，而ZmRR1HapA缺失了磷酸化的那部分，阻止了ZmMPK8的降解，导致ZmRR1HapA丰度非常高，然后ZmDREB1和ZmCesA基因的表达
