Altered striatal actin dynamics drives behavioral inflexibility in a mouse model of fragile X syndrome

这是2023年03月发表在Neuron上的关于“纹状体肌动蛋白动力学的改变导致了脆性X综合征小鼠模型的行为不灵活性”的文章。通讯作者是瑞士洛桑大学基础神经科学系的克劳迪娅巴格尼教授和蒂尔曼教授。

研究背景：

脆性X染色体综合征（Fragile X syndrome，FXS）：是一种常见的神经发育障碍（neurodevelopmental disorder，NDD），是遗传性智力障碍（ID）和自闭症谱系障碍（ASD）最常见的形式。这种疾病是由于RNA结合蛋白脆性X信使核糖核蛋白（FMRP）的丢失或突变造成的。较多的研究集中在对海马体和皮质的行为和突触可塑性，而包括纹状体在内的其他大脑区域的研究仍较少。FXS患者表现出行为灵活性的缺陷，提示纹状体可能也参与了这种行为特征的形成。

突触后密度（Postsynaptic density，PSD）：是一个定位于兴奋性突触（谷氨酸能突触最为常见）的突触后膜的电子致密区域。psd与突触后膜肌动蛋白细胞骨架相关，并组织谷氨酸能突触的结构、形态和信息交流。PSD95是PSD中最丰富的蛋白之一。

主要内容：

1. WT和FXS psds的纯化和表征

为了研究FMRP的缺失对谷氨酸能突触蛋白库的影响，作者利用带有FLAG免疫亲和标签的KI小鼠（PSD支架蛋白PSD95的C端含FLAG标签），纯化并分析PSDs及其相关蛋白。WB结果显示，PDS95及其相关蛋白(如：NR2B，ARC)仅在PSD95FLAG/FLAG-Fmr1y/+样品的洗脱液中检测到，强调了标签的特异性。

为了揭示脑区和发育上的差异，作者从P30 和P150的雄性小鼠的三个不同皮层、海马和纹状体中纯化了psd和相关蛋白。采用无标记定量质谱对54个PSD进行分析，检测到825个蛋白。在三个大脑区域间的比较显示，在不同的大脑区域之间有不同的PSD蛋白组，共包含438个蛋白质。其中，255个在所有三个脑区和两个发育阶段都被检测到，形成了psd相关蛋白的共识集。

接下来，这255个纯化蛋白中的55%被验证为突触蛋白，如20210225版的SynGO数据库中所列，太阳图显示了突触后的已知成分，特别是PSD的富集。另外24%是肌动蛋白细胞骨架和线粒体的组成部分，或参与离子运输。这三种蛋白质类别都被认为在突触上，肌动蛋白细胞骨架的成员确实也在SynGO数据库中被发现；线粒体蛋白仍然需要在SynGO中进行注释。总之，绝大多数已鉴定的蛋白都是已知的或可能的突触蛋白，这表明所使用的纯化方法允许严格分离psd和相关蛋白。剩下的一些纯化蛋白可能也可能与突触相关，但仍有待突触注释。

2. psd相关蛋白的鉴定和与人类神经系统疾病的联系

另一方面，对所有三个脑区和两个发育阶段都被检测到255个蛋白组成的PSD共识集进行的主成分分析(PCA)显示，三个脑区的样本明显分离，且在很大程度上与年龄和基因型无关。为了解是哪些蛋白驱动了脑区差异，作者将每个脑区的每个蛋白的表达水平与其他两个脑区的平均表达水平进行了比较，发现皮层82个蛋白，海马148个蛋白，纹状体136个蛋白的表达有显著差异(错误发现率[FDR]<0.1) 。在每个区域，差异表达的蛋白大致被分为其表达量高于(对数倍变化[LFC] > 0)和低于 ( LFC < 0)其他两个区域的平均表达量。

接下来，作者评估了这三个基因集是否在NDD神经发育疾病的风险基因中显著富集，NDD定义为在发育障碍基因型-表型数据库(DDG2P https://www.deciphergenomics.org/ddd/ddgenes)。通过排列分析，我们发现海马中148个蛋白中有42个(p值=0.04)和纹状体中136个蛋白中有39个(p值=0.04)是由NDD风险基因编码的。因此，在这两个区域的psd中差异表达的蛋白中有28%是由与ndd相关的基因编码的。在大脑皮层中没有观察到富集。

3. FXS纹状体PSDs 中肌动蛋白的组成和动力学发生了改变

对得到的基因进行差异表达分析，发现在皮质或海马中PSD95FLAG/FLAG-Fmr1y/-mice和PSD95FLAG/FLAG-Fmr1y/+mice中没有检测到显著变化(FDR < 0.05)。相比之下，在纹状体中，与PSD95FLAG/FLAG-Fmr1y/+mice相比PSD95FLAG/FLAG-Fmr1y/-鼠中有一个上调的(Rps15a)和四个下调的(Myh9、Myh10、Gsn和Actb)蛋白(|LFC| > 1，FDR < 0.05) 。值得注意的是，所有四种下调的蛋白都是肌动蛋白细胞骨架的内在组成部分。

野生型(WT)和FXS小鼠的皮质、海马和纹状体总提取物中PSD95水平相似，而海马和纹状体突触中PSD95水平降低，提示存在突触依赖的作用机制。对SynGO中注释的蛋白定位的表达加权分析证实，异常调控的蛋白在突触后细胞骨架和突触后肌动蛋白-细胞骨架中显著富集。

接下来，作者进行了功能富集分析，以确定PSD95FLAG/FLAG-Fmr1y/-中失调的蛋白之间可能存在的蛋白-蛋白相互作用网络,使用搜索工具为邻近基因的重复实例(STRING；https://string-db.org/)。差异表达分析中发现的10个蛋白质中有8个之间存在生物学相互作用，并在肌动蛋白-细胞骨架动力学中发挥核心作用。

为了进一步验证质谱数据，作者使用了一套新来自与PSD95FLAG/FLAG-Fmr1y/+mice和PSD95FLAG/FLAG-Fmr1y/- 纹状体的PSD纯化，证实了肌动蛋白动态网络中几种蛋白的PSD关联减少，但没有在纹状体总提取物中观察到差异 。

由于肌动蛋白-细胞骨架通过与PSD结合，在突触组织和可塑性中起着至关重要的作用，作者假设Fmr1y/-小鼠的psd中关键细胞骨架蛋白的减少可能伴随着突触附近的肌动蛋白细胞骨架的改变。分析了来自P30的WT和Fmr1y/-(无 PSD95标志)的纹状体突触神经体中丝状肌动蛋白(F-actin)和球状肌动蛋白(G-actin)(F/G比率)之间的比值，发现Fmr1y/-小鼠纹状体中F/G肌动蛋白比值显著降低，表明肌动蛋白周转发生改变。Cofilin是肌动蛋白解聚的关键因子。作者在Fmr1y/-小鼠的纹状体突触神经体中检测到总cofilin水平升高，但这种变化没有出现在海马体或皮质中。

此外，对来自纹状体、皮质和海马的总提取物进行FMRP免疫沉淀，然后进行实时荧光定量qPCR发现，cofilin mRNAF在mr1y/-的纹状体中含量降低，意味着cofilin mRNA在纹状体中特异性地与FMRP结合，表明FMRP的直接调控。这些结果表明，cofilin表达的增加可能导致F-actin的减少。

考虑到肌动蛋白丝对树突棘的重要性（actin filament可以影响spine的结构和功能），作者评估了纹状体中棘神经元(MSNs)的spine密度和形态。来自Fmr1y/-小鼠的MSN与WT相比，体外切片的形态更不成熟，而spine density保持不变。

接下来，通过引入了随机相关的C3肉毒杆菌毒素底物1(RAC1，一种小的GTPase，在促进肌动蛋白丝的组装中发挥关键作用，ca-RAC1：具有RAC1构成活性形式的病毒结构） 。加入病毒后，Rac1 mRNA水平、Rac1活性和Rac1总水平均如预期的一样增加验证病毒有效。在Fmr1y/-小鼠的背内侧纹状体中加入ca-RAC1结构体 (ca-RAC1+tdTomato，在体外导致成熟/未成熟spine比例和spine密度得到部分恢复。同时，spine成熟的缺陷伴随着成熟spine面积的减少，这些改变也被外源性ca-RAC1挽救。

为了更好地理解这种挽救背后的机制，作者使用了原代单MSNs(是纹状体的主要输出神经元），它们与皮质神经元共培养，以确保细胞的正确发育和生理机能。在这个体外实验中，Fmr1y/-小鼠的spine density降低，这取决于给定的树突节段与躯体的距离。

为明确FXS中肌动蛋白周转是否发生了改变，作者使用SiR-actin肌动蛋白荧光探针对MSNs中的F-actin进行了实时成像。荧光随时间而衰减，而衰减速率表明了肌动蛋白的周转。观察到Fmr1y/-和WT的衰减速率显著不同，Fmr1y/-衰减快，而当ca-RAC1被转染到原代MSNs中时，观察到肌动蛋白周转完全恢复。

结合上述结果研究，生化和生物信息学分析表明，FXS基因型影响 psd相关的纹状体蛋白质组，特别是与PSD相关的肌动蛋白相关蛋白的数量，这是由于cofilin的失调导致spine中肌动蛋白turnover的改变引起的。

4. FXS小鼠表现出纹状体依赖的行为灵活性受损

以上是对纹状体神经元突触形态结构研究，接下来作者想看看Fmr1y/-纹状体突触中观察到的肌动蛋白动力学缺陷是否会影响纹状体相关的行为。首先，在认知墙任务中测试了FXS小鼠（www.Sylics.com)。在这个实验中，一堵有三个入口的墙被放置在笼子里的食品分配器的前。在为期4天的连续运行的辨别学习（DL）/逆转学习（RL）任务的前2天，小鼠首先学习了食物奖励洞的位置，随后，奖励孔的位置被改变，完成任务需要获得一个新的规则。这是小鼠在RL阶段需要克服的一种行为状态（一种获得性的习惯），研究表明，这个过程需要纹状体的可塑性。在DL阶段，大多数幼年小鼠在阶段任务的第一天内达到了80%的表现标准。WT和Fmr1y/-小鼠表现出类似的表现。引人注目的是，在RL阶段，Fmr1y/-与WT小鼠相比，需要更多的尝试才能达到80%的表现标准，这表明行为具有不灵活性。接下来，分析了在RL阶段中perseverative entries和的预期条目的数量。perseverative entries被定义为进入先前(DL)奖励洞中的条目数量 ，而neutral entries被视为始终进入非奖励洞中的条目。与WT相比，Fmr1y/-小鼠的perseverative entries显著增加，但neutral entries没有显著增加。这些数据表明，Fmr1y/-小鼠小鼠的纹状体功能存在缺陷，从而导致行为僵化。

另一个与纹状体相关的任务：触屏操作平台。在这个测试中，老鼠被训练，随后在一个配备了奖励系统和触摸屏显示器的操作室中进行测试 。在可以从操作性测试中产生的不同测量中，对于这个实验，我们分析了完成的试验次数、响应类型的数量以及达到标准所需的会话次数。与已发表的文章一致，在一个较低认知能力的任务中(pairwise discrimination protocol)，Fmr1y/-老鼠没有显示在采集或反转阶段与WT的性能差异 。而在有较大认知负荷的配对联想学习任务paired-associative learning task中，与WT小鼠相比，Fmr1y/-小鼠在获得过程中表现出轻微的学习延迟。在逆转过程中，Fmr1y/-小鼠的学习延迟变得更加明显。在获得和逆转过程中Fmr1y/-存在显著的学习延迟。此外，与野生型相比，Fmr1y/-小鼠在两个过程中所需的校正试验的次数更多，产生了更高的持续性指数，并提示了增加的持续性行为。

此外，我们进行了一项主动回避测试，小鼠通过启动特定的运动反应来学习避免厌恶刺激。在3个sessions (1 session/day; 50 trials/session)) 中，小鼠暴露于条件刺激 (CS) (声音，10秒) ，随后是脚电击 (非条件刺激) ，如果小鼠穿过隔间，刺激会停止。在这种情况下，回避似乎是出于纹状体依赖的条件刺激(CS)  驱动的习惯。WT小鼠的回避能力逐渐提高以防止电击的发生，而Fmr1y/—小鼠没有 ，表明纹状体功能明显受损。

5. FMRP的背侧纹状体消融再现了FXS的行为不灵活性

研究表明，背内侧纹状体在行为灵活性中起着关键作用，许多NDDs显示纹状体缺陷。为了最终证明背内侧纹状体中FMRP的特异性缺失足以再现观察到的行为僵硬，我们在该区域特异性沉默了Fmr1。使用了包含GFP报告基因和靶向Fmr1的shRNA (AVV9-GFP-U6-m-Fmrm1-mRNA)或干扰对照shRNA(AVV9-GFP-U6-scramble-shRNA)的构建物。转染sh-Fmr1载体而不是转染干扰对照载体抑制FMRP的表达，这表明被sh-Fmr1载体诱导的FMRP阳性细胞减少 。在背内侧纹状体中注射fmr1抑制病毒或对照病毒，注射后3-5周的小鼠在DL/RL任务中进行测试。

如预期，在DL阶段，两组没有表现出差异。然而，在RL期间，注射了sh-fmr1的小鼠需要显著增加entries次数才能达到80%的表现标准 。此外，如Fmr1y/—所示，与注射sh-干扰的小鼠相比，注射sh-fmr1的小鼠的perseverative entries也显著增加，而neutral entries没有发现差异，总entries保持不变 。相比之下，在前扣带皮层(ACC) 或海马齿状回(DG）注射sh-Fmr1并不损害行为的灵活性或持续性。

总之，这些的行为实验强调了纹状体Fmr1在控制行为灵活性方面的重要性。

6. 增强肌动蛋白聚合可以改善FXS小鼠的行为不灵活性

为了测试纹状体突触中与肌动蛋白相关的改变是否是我们在Fmr1y/ —小鼠中观察到的行为僵化的基础。作者使用ca-RAC1病毒载体增强了Fmr1y/-小鼠的肌动蛋白周转。将病毒ca-RAC1或对照结构体（AVV2-CAMK2a-tdTomato）送入Fmr1y/-小鼠的背侧纹状体。然后，在注射后3~5周，对小鼠进行DL/RL任务测试。在DL阶段，两组实验组均未出现差异。然而，在Fmr1y/-小鼠中，ca-RAC1的表达改善了行为的不灵活性，这反映在ca-RAC1注射的Fmr1y/-小鼠达到80%表现标准所需的条目数量减少，并改善了持续性行为。

总的来说，正常情况下纹状体PSD中的FMRP与Cofillin mRNA 结合，抑制CFL的产生，以维持F-actin的正常turnover，而在FXS的小鼠体内，由于缺失FMRP，对CFL的抑制作用减弱，进而促进了F-actin的turnover（成熟spine减少，衰减速度加快），这种异常可以被外源性ca-Rac1挽救。