时势造英雄-空间组学的发展及技术对比
三国时期，群雄并起，如何在英雄辈出、群雄闪耀的时代割据一方、建功立业，将道、文韬、武略、心性、时运等重要因素缺一不可。近年来生命科学领域的新起之秀空间组学技术在各顶级研究所的不断求索中日益精进，各类新型方法不断更新，灵敏性、特异性、分辨率、检测通量等均成为丈量各方法长短的主要因素（图1）。
空间组学技术可按操作方式的不同大致分为基于测序的空间转录组（sST）及基于成像的空间组（iST）。sST主要应用含空间ID捕获簇阵列的芯片对转录本进行捕获。其设计策略决定了本方法具有全转录组捕获、Spots分辨率、捕获效率较iST低以及横向扩散风险。iST主要以预设探针对靶标进行捕获，经多重多轮荧光成像来解读各转录本，以高捕获效率的单分子分辨率来重构分子空间图谱。由各方法的实践途径决定了iST相对于sST来说具有更高的检测效率同时也具有更高的空间分辨率。
高手云集-基于成像的空间组技术iST的简介与对比
按不同的探针设计、信号放大、解码方式、信息计算方法分为多种不同的iST。已商业的iST平台有10X的 Xenium, Nanostring的CosMx,及Vizgen的 MERSCOPE，Molecular Resolve Biosciences的 Cartography等，实验室水平的方法有MERFISH、STARmap PLUS和EEL FISH等。其中Xenium、STARmap PLUS以锁式探针捕获转录本，以滚环扩增放大信号，再经逐轮测序来解码各转录本的空间信息。本类方法具有所需初级探针数量少、成本较低、信噪比高、碱基编码等特点。Cartography、EEL FISH、MERFISH及CosMx均属smFISH类型的方法，而解码方式略有不同，前两者属于组合式单分子荧光原位杂交，后两者属于序列荧光编码。本类方法具有检测效率高，所需初级探针较多、成本高、信号稀释等特点。依赖多重多轮成像来解码的技术均需经过多轮单分子对准，而此过程会由成像质量差异而引入错误，从而导致检测效率降低。iST的技术共有特点是检测效率高、分辨率高。
刀锋对决-空间组学技术的并行对比基准测试
如何选择适合自己的实验方案需要更为详细的用户指导，近日来两篇预印本均对iST进行了平行实验。一篇来源于Broad研究所的Samouil L. Farhi团队2。以多平台的多个panel并行检测了23种肿瘤组织类型的多张回顾性病理样本。另一篇来源于纽约基因组中心的Rahul Satija团队3。以已发表的经6种iST方法所绘制的多套小鼠大脑数据集进行了并行对比测试。前者是以操作流程测试样本来比较各类方法的长短，结果显示Xenium平台在多项指标均表现优异；后者是以已发表数据来进行并行的对比分析，其中无论是灵敏性、特异性还是细胞分割流程MERSCOPE均性能最佳。
Broad研究所的Samouil L. Farhi团队应用已商业化的三个iST平台对23种肿瘤及正常组织微整列样本进行性能的平行测试2。他们发现在匹配上基因中在不牺牲特异性的情况下10X Xenium显示出更高的每个基因转录本计数，但所有三个平台均符合对应的RNA-seq数据集，也可以进行空间分辨的细胞分型，尽管存在不同的错误发现率、细胞分割错误频率和不同程度的聚类亚群。本研究提供了一个全面的基准评测来指导iST方法的选择。
以下是详尽的性能指标对比数据（图3）。在工作流程方面，Xenium提供了最短和最少动手的工作流程；在检测效率方面，Xenium产生的转录本数量最多，其次是CosMx，最后是MERSCOPE；在组织特异性方面 ，Xenium和MERSCOPE显示出一致的高特异性，CosMx在检测低表达基因时容易出错， MERSCOPE则对样本的完整性要求较高；在细胞分割流程上，Xenium的分割包表现不佳，而MERSCOPE和Xenium更接近细胞边界，经过率后 Xenium总体上保留了的最高细胞数量，Xenium和MERSCOPE均能有效识别不同谱系细胞，而CosMx则存在更多的双阳性细胞；在panel选择上，1000plex的panel比300 plex的panel能回答更多的问题，然而CosMx表现出较高的假阳性率和较低的敏感性。因此根据感兴趣的细胞类型来选择基因集（即靶向空间组）将能更好应用资源来发挥最佳性能，靶向空间组也是未来应用的趋势。
Rahul Satija团队应用公开的小鼠大脑数据集对商业或学术上开发的六种原位基因表达谱方法进行了比较基准分析3。他们认为标准的灵敏度指标，如每个细胞检测到的独特分子的数量，不能在数据集之间直接进行比较，因为影响特异性的脱靶分子假信号发生率存在实质性差异。为了应对这些挑战，他们研究了各种潜在的分子假信号来源，开发了新的指标来控制它们，并利用这些指标来评估和比较不同的原位技术。最后，他们展示了分子假阳性如何严重混淆空间感知差异表达分析，在解释下游结果时需要谨慎。他们的分析为原位空间技术的选择、处理和解析提供了指导。
他们使用通用分割流程重新分析了六种技术中的五种，能更好地进行跨数据集的敏感性和特异性比较（图4）。在所有技术中483基因panel的MERSCOPE数据集在敏感性和特异性之间表现出最佳的权衡；由于细胞分割技术的差异248基因panel的Xenium技术也表现出了良好的性能，Xenium的细胞分割流程要比实际观察到的大的多，这样也导致了错误分子的大量增加（图5）；99基因panel的Molecular Cartography，在每个基因灵敏度也极高。1147个基因的MERFISH数据集在保持高度复杂性的同时实现强大性能；EEL FISH数据集灵敏性最低，由于该技术将所有转录物电泳至特殊处理的玻片上，减少了组织背景，更重要的是加快成像时间，从而可实现更大面积的成像。本研究未实现跨组织类型、样本类型、相同基因集等因素的对比，因此有待进一步完善。另外没有一种细胞分割方式使用于所有组织类型及应用场景，但错误的分子分配将导致下游分析出现非特异偏差，进而这一问题也将是将来空间组学技术努力改进的方向。
综上所述，无论是全流程运行的基准测评还是已有数据的基准测评，均体现出了来源于方法设计上的优势以及细胞分割带来的风险。其中我们看到以锁式探针捕获靶标，经RCA放大信号的Xenium平台均展示出了较高的捕获效率，但由于其细胞分割方式容易影响其特异性。RCA放大信号技术可很大程度提高信号质量，利于提供后续多轮对准中信号的复现性，从而保存了较高的检测效率。灵敏性与特异性从来都是双刃剑，平衡这两者将利于我们更高保真度的观察下游的细胞通讯等分析。
参考文献：
[if !supportLists]1. [endif]Rao, A., Barkley, D., França, G.S. et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature 596, 211–220 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03634-9
[if !supportLists]2. [endif]Systematic benchmarking of imaging spatial transcriptomics platforms in FFPE tissues
Huan Wang, Ruixu Huang, Jack Nelson, Ce Gao, Miles Tran, Anna Yeaton, Kristen Felt, Kathleen L. Pfaff, Teri Bowman, Scott J. Rodig, Kevin Wei, Brittany A. Goods, Samouil L. Farhi
bioRxiv 2023.12.07.570603; doi: https://doi.org/10.1101/2023.12.07.570603
[if !supportLists]3. [endif]Comparative analysis of multiplexed in situ gene expression profiling technologies
Austin Hartman, Rahul Satija
bioRxiv 2024.01.11.575135; doi: https://doi.org/10.1101/2024.01.11.575135
