影响因子：7.4
研究概述：失调的Notch信号导致乳腺癌的发生和发展，但目前还缺乏有效的工具来测量Notch信号在乳腺癌亚型中的水平以及对系统疗法的反应。有必要建立Notch信号的转录组特征，用于监测未来Notch靶向疗法的效果，以及了解Notch信号的改变是否是当前乳腺癌疗法的目标效应。为了生成这一特征，作者建立了这样一个分类器，首先从六个基底样乳腺癌细胞系中识别出了Notch调节基因，这些细胞系分别通过在固定的Notch配体Jagged1上培养或通过γ-分泌酶抑制剂阻断Notch，从而使Notch信号升高或降低。作者从这些Notch调控基因中开发出了候选转录组特征，这些特征在乳腺癌患者数据集（TCGA-BRCA队列）和更广泛的乳腺癌细胞系队列中进行了训练，并在独立数据集中进行验证。
研究背景：
Notch信号是一种在进化过程中高度保守的细胞-细胞通讯机制，它调节包括乳腺在内的大多数器官的细胞命运决定和组织稳态。配体-受体相互作用导致蛋白水解处理事件，最终通过γ-分泌酶复合物的裂解（第3位点S3裂解）释放出Notch受体胞内结构域（NotchICD）（Notch受体信号传导示意图见图1A）。转位到细胞核后，NotchICD与MAML和DNA结合蛋白CSL（又称RBPJ或CBF-1）形成三聚体复合物，调节下游基因的激活（图1A）。
研究结果：
确定Notch转录组特征候选基因的检测方法
为了确定乳腺癌的Notch转录特征，作者首先着手确定乳腺癌中受Notch信号调控的基因。为此，作者建立了一种检测方法，在表达NOTCH受体的六种基底样细胞系（BT20、HCC1187、HCC1599、HCC70、MDAMB436和MDAMB468）中对Notch信号水平的调节进行转录组学解读。对这些细胞系进行培养，并对其进行不同程度的Notch激活：将细胞培养在固定的Jagged1配体上可实现Notch信号的增强（"Notch on"）；在存在γ分泌酶抑制剂DAPT的情况下培养细胞可实现Notch信号的阻断（"Notch off"），而DMSO则用于Notch信号的"基态"（实验示意图见图1B）。在激活/抑制后的8小时和72小时，对六种细胞系进行了Bulk转录组学分析，以捕捉Notch调控导致的直接以及更长期的、可能是继发性的基因表达差异（图1B）。
在分析的所有六种细胞系中，每种细胞系中至少有一种公认的Notch靶基因HES1和NRARP在8小时和/或72小时后出现了预期的上调和下调（图1C），证实了该检测方法的有效性。在对转录组数据进行主成分分析（PCA）降维时，各细胞系的转录组彼此截然不同（图1D），Notch信号的激活或阻断并没有重置整个转录组，而是诱发了更微妙的差异。因此，变异的主要来源是细胞系之间的转录组差异，其次是处理时间，而Notch调控的影响较小，与主成分6、7和10显著相关，分别占数据集总变异的3.5%、2.1%和0.5%（图1E）。总之，作者建立了一种检测方法，使作者能够识别基底样乳腺癌细胞系中Notch诱导的转录组差异，并建立Notch标志的候选基因。
确定稳健一致的20个基因Notch转录组特征
有了在8小时和72小时时间点激活或阻断Notch信号传导的数据集，作者接下来寻找六种细胞系在所有可能条件和时间点之间的差异表达基因（DEGs）。由于Notch信号同时导致下游基因表达的增加和减少，作者考虑了DEGs和由不同实验点上调或下调基因组成的潜在特征。在74个可能的比较结果中，作者只考虑了P值分布呈左倾斜且DEGs至少为100个的差异表达结果（图2A），最终选出了14个差异表达的比较结果（图2B）。每个特征的最佳基因数是根据最大的一致性得分和最小的经验P值来选择的，最小的基因集大小在10到30个基因之间。这一分析显示有三个特征的一致性得分大于0.2：5号特征（15个基因）；9号特征（17个基因）和11号特征（20个基因）（图2C），这三个特征被选中进行进一步分析。
为了进一步探索这三个特征的准确性和稳健性，作者使用与上述相同的主要实验装置生成了一个新的转录组数据集，用于激活（Jagged1）和阻断（DAPT）Notch信号传导，但这次作者使用了一个更大的19个乳腺癌细胞系面板（图2D）。该小组包括10个基底样细胞系、3个LuminalA细胞系和6个HER2富集的乳腺癌细胞系（图2D)。PCA分析显示，基底样细胞系、LuminalA细胞系和HER2富集细胞系在很大程度上根据肿瘤亚型进行了不同的聚类（图2E）。至于六种基底样细胞系的转录组分析（图1D），Notch信号增强或减弱引起的转录组差异与细胞系特定差异相比较小（图2E）。接下来，作者使用基因组富集分析（GSEA）和接收者操作特征曲线分析（ROC）来测试这三个特征在19个细胞系转录组中的表现。在三种不同条件的GSEA分析中（图2F），根据NotchonvsNotchof的8小时和72小时时间点的上调DEGs的交叉得出的11号特征一直优于5号和9号特征。
20个基因转录组Notch特征的性质
所选的转录组特征按排列顺序由20个基因组成（图3A）。所有20个基因都含有至少一个CSL结合位点（图3B），位于启动子区域，定义为转录起始位点（TSS），其中17个基因（SEMA5B、NRARP、PRELP、HEYL、FAT2、HEY1、KRT5、NPR3、KRT14、FLT1、RHOV、TNFRSF19、JAG1、MT1X、HEY2、PDGFRB和ZNF469）先前已在不同模型细胞系的ChIP-seq中被确定为CSL靶点。将这些基因绘制成KEGG图网时，特征中的一些基因（JAG1、HEY1、HEY2和HEYL）与"乳腺癌"相关联，而同样的四个基因加上PDGFRB和KIT则与"癌症中的通路"相关联（图3C）。总之，数据显示，Notch特征中的20个基因可能代表了Notch的直接下游基因，其中几个基因与不同的通路有关，如乳腺癌，或在通路富集分析中与Notch有关。
在两个独立的乳腺癌数据集中验证20基因Notch转录组特征
有了20基因特征后，作者探讨了它是否能在另外两个乳腺癌患者数据集（METABRIC和Oslo2）中显示出良好的一致性得分。该特征在METABRIC（0.16）和Oslo2（0.16）中均显示出显著的一致性得分，经验p值<10-5（表1）。20基因特征的平均一致性得分高于5号和9号特征，它们的一致性得分分别为0.12和0.12（5号特征）和0.10和0.19（9号特征），与19细胞系转录组数据集一致（见图2F）。这些数据共同表明，在其他独立的乳腺癌数据集中验证时，20基因特征也表现出稳健的一致性得分。
将20个基因Notch转录组特征与之前建立的特征进行比较
之前已经有人尝试在包括乳腺癌在内的各种生理环境中建立Notch转录组特征，将作者的20个基因特征与已发表的特征进行比较。通过计算一致性得分和P值来估计已发表特征的质量。Vilimas等人的"NOTCH1靶向下"特征显示出比20个基因特征更高的一致性得分（TCGABRCA=0.28，METABRIC=0.19，Oslo2=0.22）（图4A）。此外，作者还分析了三个数据集中PAM50亚型的特定一致性得分，大多数已发表的特征在基底样亚型中一致性得分较低（<0.12）。为了探究肿瘤纯度、基质和免疫渗透是否会对各种基因特征的性质产生影响，作者使用ESTIMATE方法推断了免疫和基质含量。包括本文报告的20个基因特征在内的大多数特征与Immune score或Stromal score没有明显的相关性，但Vilimas等人和Klinakis等人的特征与免疫浸润高度相关，而其他两个特征则与所有测试患者群的基质含量相关（图4B）。
20基因特征在基底样乳腺癌细胞系和患者数据集中显示出更高的特征得分
在患者和细胞系数据集中验证了20基因特征的一致性得分后，作者接下来利用该特征来了解不同的乳腺癌亚型是否具有不同水平的Notch信号。作者首先对代表基底样、LuminalA和HER2富集亚型的19个细胞系进行了转录组分析。在基底样细胞系中，基底状态下的绝对特征得分明显更高（图5A），在基底样细胞系中，比较"Notch开启"与"Notch关闭"条件下与基底状态下的相对特征得分差异也很明显（图5B）。此外，与基态特征得分相比，"Notch开启"条件下的相对特征得分增加，而"Notch关闭"条件下的相对特征得分减少（图5C）。接下来，作者研究了三个患者数据集中20个基因特征的特征得分与PAM50分子亚型分类的关系。在TCGA、METABRIC和Oslo2数据集中，基底样/TNBC和正常型乳腺癌的平均特征得分最高，其次是LuminalA亚型，HER2和LuminalB亚型的特征得分较低（图5D）。
分析PROMIX和BEAUTY乳腺癌队列中乳腺癌治疗反应的20个基因特征得分
为了深入了解Notch信号水平在乳腺癌治疗反应和治疗结果中的变化情况，作者首先分析了PROMIX试验的数据。在接受两个周期的表柔比星和多西他赛治疗后，有放射学证据显示有残留疾病的患者子集（21例腔A型患者、27例腔B型患者和21例TNBC患者）中，有配对活检样本可用于转录组学分析，TNBC患者组的特征得分（ssGSEA）在治疗后增加（图6A）。此外，TNBC患者的Notch特征基线（即治疗开始前）最高（图6A），这与图5中的结果一致（图6A）。基线Notch特征得分较低的患者比Notch特征得分较高的患者显示出更好的无病生存期（DFS）趋势（图6B），Notch核心特征也是如此，而相反，例如Leontovich等人的特征显示出相反的相关性。与没有淋巴结转移的患者相比，有淋巴结转移的患者治疗前原发肿瘤的特征得分较低（图6C）。
接下来，作者研究了前瞻性乳腺癌基因组指导治疗研究（BEAUTY）中Notch信号对治疗的响应水平。通过基因组变异分析（GSVA）评估，Te20基因特征得分在基线TNBC亚型中最高，其次是LuminalA、HER2+和LuminalB亚型（图7A）。比较基线和手术时的GSVA，HER2+、LuminalA和LuminalB患者的GSVA值增加，而TNBC组的GSVA值减少（图7B）。在分析TNBC组治疗应答者与非应答者治疗前的GSVA特征评分时，非应答者组在治疗开始前的GSVA值更高（图7C）。同样，之前发表的大多数特征以及Notch核心特征在非应答组中的特征得分更高。
研究总结：
为了满足对监测Notch信号工具的需求，作者在本报告中描述了20个基因Notch转录组特征。作者首先通过对具有左偏P值分布和至少100个DEGs的比较进行分析，确定了在六个基底样细胞系中对Notch信号调控有显著转录组反应的基因。这样就从原本74个可能的比较中产生了14个候选比较。以TCGA-BRCA患者数据集为训练数据集，通过机器学习方法评估各种基因组合的一致性得分，确定了三种候选特征。在对19种不同的乳腺癌细胞系进行测试时，20个基因特征（特征#11）成为最佳特征。随后，20个基因特征在另外两个独立的数据集：METABRIC和Oslo2数据集中得到了验证，与以前发表的特征相比，它的一致性得分和肿瘤特异性都有所提高。此外，基底样乳腺癌的特征得分特别高，表明这种亚型的Notch信号水平更高。在PROMIX和BEAUTY患者队列中，新辅助治疗后特征得分增加，特征得分越低，临床预后越好。20个基因转录特征将成为评估未来Notch靶向疗法对乳腺癌的反应、了解传统乳腺癌疗法对Notch信号传导的潜在影响以及更好地对患者进行治疗分层的重要工具。
