课堂笔记
RNA-Seq
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标准测序
6G数据， 6X1024X1024X1024 位（个碱基）
→虽然会有波动，会受一些随机误差影响，但是reads数很多，coverage很高，表达量的测量很准
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overview：
- RNA-Seq
① RNA →mRNA → 反转录为DNA
② 打断为fragments
③ 加上adapter
④ pcr扩增
⑤ 建库（双链，两条链+ - 都有）
⑥ 基因测序（双端vs单端测序）
illumina 双端测序，一端测正链，一端测负链 - mapping 到基因组上
① De novo assembly: reads 能overlap的，拼起来就行
② annotation based
③ genome guided assemly - 计总reads数
- 统计：差异表达分析
- system biology
- RNA-Seq
基因组测序更关注序列
RNA-Seq更关注 有多少reads map到了参考基因组，即关注表达量junction reads (2%-3%)
会体现内含子没表达导致的reads空缺，即还能体现剪切方式poly A end reads( poly A加尾
RNA上才有，加尾酶加上的，在mapping时会导致错配
PolyA 与 rRNA
rRNA 占90%,rRNA没有poly A尾巴
法1. poly A selection
- 用oligo-dT磁珠将A提出来，去得很干净， 可以衡量RNA降解
- 3' Bias：如果RNA发生降解，3’端测到的表达量多，5’端少
- 但不能去掉无polyA的RNA和 pre-mRNA
法2. 最后通过探针把rRNA去掉
- 因为有时候要看别的RNA，通过沉降等方法，去掉核糖体，会留下游离核糖体，且有些RNA不在核糖体里，会留下约30%rRNA
- 在基因组上，rRNA的基因有很多，能mapping到很多地方，要丢掉这些reads
stranded vs non-stranded
- 基因组上 很多基因是3’尾巴对3'尾巴
- RNA在基因组上有方向5’→3’，当3'端基因重合，将无法确定reads是源于哪个基因
- stranded：只测固定方向的reads，将read1反向互补，确定RNA方向，确定其来自DNA正链还是负链
- 基因表示图： 从细到粗——内含子，非编码区，编码区，| 起始子
PCR duplication
- 做RNA-seq 表达量分析时 去掉PCR重复
- 找突变，如果duplication很多，会让软件以为该处真的有突变（表达量很高的时候要注意，不要误杀）
fastqc software
quality control
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ASCII-33 表示quality score ：0-255
节约磁盘空间，质量得分（可能占用两个字符）按一定规则（Phred+33或Phred+64）被转换为单个字符表示。 - MAPQ = -10lgP碱基错误率
- pred scale碱基错误率= 10^^（-score/10）
- adapter content:
有时候会测到接头adapter上去，导致mapping不到基因组，mapping率很低
有的软件能去掉adapter，得到不等长的fragment reads，如果软件只能等长，就选取能接受的长度（选择adapter的量和reads长度可接受的长度，权衡）
Hisat2
能够将junction reads mapping到基因组上
uniquely mapped reads
- 做表达量分析的时候，只留唯一mapping的reads即可（有的基因有同源基因，有的有拷贝，或有重复序列）
- unmapped reads 比如环状RNA，或有编辑过的RNA，基因融合了的，突变了的，是否重要取决于研究目的，要挖掘信息！
output of mapping
Sam or Bam（二进制） 格式
一行一个read，每行11列
sam格式讲解：https://www.jianshu.com/p/386f520e5de1
sam flag explain：https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html
cigar：会告诉我们是否是junction reads
如 ‘6M237N44M’： 6个连续mapping，237个跳过，44个连续mappingsamtools： linux专门读取bam或sam的软件
samtools -q xx -f xx
可以view，filter，sort，index, merge ,rmoce PCR duplication, Tview, SNP calling
数据可视化
- UCSC genome browser：把自己的track放在云端，给UCSC一个链接就能和UCSC的数据结合起来看
- IGV tool:本地看
基因表达量测定:看表达出多少转录本
长的RNA打断出来的reads多，因此要有衡量标准
- RPKM：看有多少测序出的reads，reads per kilobase per million reads mapped，理论上只与表达量有关，表达量与基因长度、测序深度无关
- FPKM：RPKM算法优化 fragments per million reads mapped ，fragments = cDNA insert
- TPM: Transcript per million 看有多少转录本,RSEM软件汇报
详细讲解：https://www.jianshu.com/p/1940c5954c81
差异表达基因
- cutdiff: 分析GTF文件
- EdgeR : 较流行较好，
FC 差异倍数
CPM平均表达量：表达量多，次数多 即概率里counts多
红 差异显著
黑 不显著
splicing analysis
看junction reads的拼接方式，可以定量剪切方式，counts数很重要！
软件 rMATs
splicing factors
谁让剪切方式产生差异的CLIP-seq
ChIP-Seq：https://zhuanlan.zhihu.com/p/295399497
CLIP、RIP-seq：https://www.jianshu.com/p/fff90b2e8f2d
RNA编辑
！！ 一点点错配都有可能出现大问题！ 软件算法不完善等都可能出大问题！用的时候要搞清楚原理，否则很容易出问题
samtools → IGV 可视化
conda install samtools=1.9
conda的samtools版本太低，用的时候会报错，装的时候指定好版本号
samtools view -q 30 -f 64 xx.bam |more
txt结果 用excel 打开 open 可以把IJC_SAMPLE_1， SJC_SAMPLE_1, IJC-SAMPLE_2 ,SJC_SAMPLE_2改为字符串类型
