一、高通量测序平台第一个测序技术——焦磷酸测序
- 基本过程：建库——信号放大（PCR）——测序。
- 两种接头序列，其中一种含有生物素，可以用链霉亲和素磁珠捕获和分离。
- 通过变性将不带生物素标记的序列洗脱。
- emulsion PCR（乳液PCR）——油包水结构。
二、454文库制备方式
1、短片段末端配对文库制备（Short Pair End library preparation）
- 打断后的gDNA进行EcoR I位点甲基化修饰。
- 引入特定接头——同时带“EcoRⅠ”位点、“MmeⅠ”酶切位点和生物素。
- gDNA中的EcoRⅠ位点由于甲基化修饰而不能被酶切消化，保证基因组结构完整；而接头的EcoRⅠ位点被酶切，产生粘性末端进行环化，含有生物素标记。
- 在接头上再进行MmeⅠ的酶切将环状分子打开，只保留了具有internal接头的序列，再进行接头连接。
- 最后测序的两端序列在比对回基因组上的物理距离即是起始打断长度。
2、长片段末端配对文库制备（Long Pair End library preparation）
- DNA分子打断： ~20k、 ~8k、 ~3k 。
- 接头有loxp位点——具有方向性，可产生粘性末端，只有正确加入的接头才可以进行环化，未环化部分——即线性分子，会被线性酶切酶消化。
- 测序后的末端序列比对回基因组上的长度分别为20k、8k、3k。
三、序列特征
- 两端primer——PCR primer和Sequencing primer。
- 454特有key序列（TCAG）——用于信号校正。
- MID序列——每个分子独有一个MID序列（标签），识别每个分子来源，以减轻PCR duplication的影响。
四、emPCR
- 单链文库和beads进行结合，加入矿物油高速震荡，获得乳化油包水体系：
一个beads一个分子——理想型；
一个beads多条分子；
只有分子；
只有beads； - 经过扩增可获得数十万条固定化的单克隆模板。
五、454测序技术原理
在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和荧光素酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。
焦磷酸测序法：每合成1分子的核苷酸，即释放1分子的焦磷酸（PPi）和过硫酸铵（APS）在硫酸化酶（Sulfurylase）催化下释放出ATP，ATP提供能量使荧光素（luciferin）在酶催化下氧化并释放出光信号被CCD识别而完成一个循环的测序反应。
- 以key序列四种碱基信号为基准判断判断碱基数量和类型，信号不足1mer的碱基信号的会判为噪音。
- 454在二代测序中读长最长。
