Multi-Omics Profiling Suggesting Intratumoral Mast Cells as Predictive Index of Breast Cancer Lung Metastasis

多组学分析提示肿瘤内肥大细胞是乳腺癌肺转移的预测指标

发表期刊：Front Oncol

发表日期：2022 Jan 17

DOI:  10.3389/fonc.2021.788778

一、背景

        乳腺癌是全世界妇女癌症死亡的主要原因之一。大多数乳腺癌引起的死亡是由远处转移引起的，即使原发肿瘤被切除后，远处转移也是致命的。据报道，大多数转移的驱动因素可以在原发肿瘤中找到，大量的肺转移相关基因可以促进乳腺内和肺部的增殖。原发性肿瘤也可以通过调节传播前后的全身性和继发性肿瘤微环境来影响转移。

        肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）通常可以在肿瘤的基质和实质中找到。TIL状态被认为可以独立预测患者的预后、淋巴结转移状态和治疗反应。肥大细胞是先天性免疫细胞，其特点是具有炎症介质的颗粒，主要以其在过敏反应中的作用而闻名。

二、材料与方法

1.数据来源

1）四个已发表的具有匹配临床和mRNA数据的数据集：欧洲基因组-表型组档案（RRID：SCR_004944）中METABRIC的1302名乳腺癌患者中的479名被纳入；来自TCGA数据集的1109名乳腺癌患者中的448名被纳入；来自基因表达总库（GEO）的82名（GSE2603）和58名（GSE5327）患者

2）TCGA队列的VarScan软件检测到的突变数据从GDC下载，上述449名患者中找到了399名乳腺癌患者的匹配突变数据

3）人类样本：20份乳腺癌患者的组织石蜡切片

2.实验流程

1）肿瘤微环境中细胞丰度的计算：xCell

2）基因组富集分析（GSEA）

3）加权相关网络分析（WGCNA）

4）差异表达基因的鉴定：将GSE2603数据集中的82名乳腺癌患者根据其转移情况分为两组，肺转移组和无转移组；使用R的'LIMMA'包鉴定差异基因。

5）突变景观可视化：TCGA队列中383名没有转移的乳腺癌患者和13名有肺转移的乳腺癌患者的突变数据

6）肿瘤免疫原性分析：TCGA队列中每个样本的免疫分数（IPS）是从癌症免疫组数据库（TCIA）获得的；对于只在转移到肺部的乳腺肿瘤中出现的新抗原起源蛋白，用Cytoscape软件中的GeneMANIA插件研究了这些新抗原起源蛋白之间的联系

7）肺转移的预测：ROC曲线、生存分析

8）功能充实度分析：基因本体论（GO）富集分析

9）免疫组织化学（IHC）

10）重新利用CMAP和FDA批准的药物对抗乳腺癌肺转移：针对乳腺癌肺转移的CMAP药物的再利用是在乳腺癌肺转移相关基因列表和CMAP扰动特征的共同基因上进行的

三、实验结果

01 - GSE2603队列的免疫情况表明有无肺转移的乳腺癌患者有不同的免疫细胞浸润

        为了探索有无肺转移的原发肿瘤的微环境，作者估计了GSE2603队列中64种免疫和基质细胞的相对丰度（图1A、B）。进行相关分析以了解51种细胞类型在肿瘤微环境中的分布模式（补充图1）。在TILs中，发现CD4+T细胞、CD4+幼稚T细胞、CD8+T细胞、嗜酸性细胞和肥大细胞在没有肺转移的乳腺癌患者中明显富集，而pro B细胞、中性粒细胞和Th2细胞在有肺转移的乳腺癌患者中明显富集（图1C）。两组之间具体比较了与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）特征、人类白细胞抗原（HLA）分子、干扰素（IFN）γ特征、免疫抑制基因和免疫刺激基因相关的免疫基因。与CTL和IFN gamma相关的基因，包括CD8A、CD8B和CXCL9，在无转移组中表达较高。在肺转移组，HLA DOA和HLA DPB1等HLA分子以及ICOS、IL2RA、IL6R和TNFSF13等免疫刺激基因的表达水平更高（图1D）。还检查了两组中趋化因子的表达水平，肺转移组的CCL13、CCL18、CXCL1、CXCL6、HTN3和SEMA4F表达水平较高，而无转移组的CCL19、CXCL12、CXCL14、CXCL9和SEMA3F表达水平较高（图1E）。肺转移组和无转移组有不同的趋化因子谱，这可能是导致这两组免疫细胞浸润不同的原因。

图1 GSE2603队列的免疫状况

补充图1    51种类型的细胞的相关矩阵

02 - TCGA队列有无肺转移的乳腺癌患者有不同的突变基因

        一般来说，容易发生远处转移的恶性肿瘤具有较高的突变负担。作者绘制了TCGA队列中发生肺转移的乳腺癌患者原发肿瘤中前30个高突变基因的热图（图2A）。TP53是最经常突变的基因。TP53和TTN、PER3被检测到是相互排斥的基因组，而PIK3CA、VAC14、KMT2C、FLG2、ERBB3倾向于共同出现，MUC4、PLXNA3和NALCN也倾向于共同出现，ITPR2和CHD6、FMN2和WDR17也形成共同出现的配对（图2B）。在变异体中，错义突变排在首位，其次是无义突变和帧移缺失，单核苷酸多态性（SNP）占了大部分的变体（图2C）。探讨了无转移组和肺转移组之间的差异突变基因，9个基因在肺转移组中明显高度突变（图2D），包括TP53。然而，两组之间的突变量没有差异。虽然有或没有肺转移的乳腺癌患者的突变量没有差异，但两组患者的突变情况不同。

图2 TCGA队列中肺部转移的乳腺癌患者的突变情况

03 - 乳腺癌肺转移往往具有更多恶性特征和较不强烈的免疫反应

        作者比较了其他参数，以找到参与乳腺癌肺转移的因素。肺转移组的SCNA水平更高（补充图3B），两组的HRD和肿瘤内异质性相当（补充图3C，D）。肿瘤突变可以产生新的抗原，从而吸引免疫细胞进入肿瘤微环境。然而，两组之间的单核苷酸变体（SNV）新抗原水平没有差异（补充图3E）。CTA也能够刺激免疫反应，在肺转移组中更高（补充图3F）。IPS评分作为一种免疫反应预测指标，在两组中具有比较性（补充图3G）。肺转移组的TCR均匀性得分较高，说明与无转移组相比，TCR的多样性下降（补充图3H）。仅在肺转移组出现的新抗原起源蛋白在 "细胞-细胞连接装配"、"顶端连接装配 "和 "细胞质模式识别受体信号通路 "中富集（补充图4A, B）。

补充图3 TCGA 队列中伴有或不伴有肺转移的乳腺癌患者的免疫原性。

补充图4 乳腺癌患者肺部转移的新抗原

        GSE2603队列中的乳腺癌患者的GSEA分析显示有13个与肺转移相关的重要术语，包括癌症的标志“糖酵解”，“缺氧”，“ATF4激活基因以响应内质网应激”，“线粒体异常”，“细胞衰老的负调节”等。（补充图5）。

补充图5 GSE2603队列中乳腺癌患者的GSEA分析

一般来说，乳腺癌转移到肺部往往具有更多的恶性特征，但未能激活更强烈的免疫反应。

04 - 免疫相关的枢纽基因参与乳腺癌肺转移

        利用GSE2603队列中1719个IRG的转录数据进行了WGCNA分析，共产生了7个非灰色模块（图3A），在这些模块中，黄色模块与乳腺癌肺转移的相关性最高(图3B)。模块成员和基因意义的散点图描绘了黄色模块中每个基因的显著相关性（图3C）。因此，黄色模块中的所有128个基因都被认为与乳腺癌转移到肺部高度相关。还对GSE2603队列中没有或有肺转移的乳腺癌患者进行DEmRNAs分析（图3D）。发现有2178个差异表达的基因，其中955个在肺转移组中上调，1223个下调。利用Venn图找到肺转移组中上调的基因与黄色模块中的基因的重叠，这些基因被视为枢纽基因，用于后续的功能富集分析（图3E）。

图3 识别乳腺癌转移到肺部的免疫相关枢纽基因

        对枢纽基因进行GO分析，表明枢纽基因参与了上述大部分的转移级联，从而促进了肺转移的发生。(补充图6A )。它们促进了血管的发育和血行转移，促进了迁移，创造了免疫抑制环境，重塑了代谢，并帮助转移癌细胞适应肺部微环境，形成转移灶。

补充图6 肥大细胞分量和存活率

05 - 低肥大细胞分数可能是乳腺癌患者肺转移的一个指标

        与无转移组相比，作者发现在GSE2603队列（图4A）、GSE5327队列（图4B）和TCGA队列（图4C）中，有肺转移的乳腺癌患者的肥大细胞分数明显降低。METABRIC队列中两个亚组患者的肥大细胞比例是相同的（图4D）。而在GSE2603队列（图4E）、GSE5327队列（图4F）、TCGA队列（图4G）中，肥大细胞含量较低的患者往往预后较差，但在METABRIC队列中却无法有统计学意义（图4H）。此外，肥大细胞部分在GSE2603队列中与肺部无转移生存期明显正相关，在GSE5327队列中也显示出类似的趋势（补充图6B，C）。对其他类型的免疫细胞也做了类似的分析，但肥大细胞在四个队列中表现出最大的一致性。

图4 有肺转移的乳腺癌患者的肥大细胞数量较少

        用10年随访后没有转移的乳腺癌患者和有肺转移的乳腺癌患者的20个肿瘤切片来评估肥大细胞的含量。肥大细胞既位于瘤周脂肪组织中，又与肿瘤细胞闭合（图4I）。正如之前所示，无转移组的肥大细胞水平明显高于肺转移组（图4J）。作者假设，低肥大细胞部分可能作为乳腺癌患者肺转移的一个指标。对合并队列进行了Meta分析，以评估低肥大细胞水平是否是预测肺转移的一个有希望的标志物。结果显示，在1067名患者中，肥大细胞低分的患者比肥大细胞高分的患者表现出更高的肺转移风险（图5A）。肥大细胞部分用于肺转移风险预测的AUC在GSE2603队列中是0.682（图5B），在GSE5327队列中是0.798（图5C），在TCGA队列中是0.708（图5D），而在METABRIC队列中是0.521（图5E）。然后用肥大细胞分数将乳腺癌患者分层为两个亚型（亚型1：低肥大细胞组和亚型2：高肥大细胞组），发现低肥大细胞亚型的增殖评分、伤口愈合评分和瘤内异质性都明显较高（图5F）。低肥大细胞亚型也有较高的CTA，较高的突变负担和较高的新抗原负荷，这表明该亚型的免疫原性更高（图5G）。基因组不稳定性相关参数在1号亚型中也较高，包括段数、改变的部分、非整倍体评分和HRD评分（图5H）。探讨了两个亚型之间的差异突变基因，TP53在低肥大细胞亚型中突变的频率明显更高（图5I）。简而言之，低肥大细胞部分定义了一个高度增殖的乳腺肿瘤亚型，具有较高的突变负担，并容易发生肺转移（图5J）。

图5 肥大细胞比例低可能是乳腺癌患者肺部转移的一个指标

06 - 前转移IRG与肥大细胞组分呈显著负相关

        据报道，雌激素驱动的CXCL12可招募肥大细胞。CXCL12水平在肺转移组中明显偏低（图1E），通过相关分析，CXCL12表达水平与肥大细胞分数之间存在正相关关系（补充图7）。此外，我们确定的上述促转移IRG的表达水平与肥大细胞部分存在明显的负相关，包括MYC、AKT1、MAP2K1、NCK1、PLAUR、PSAT1和S100A9。

补充图7 前转移 IRGs 和肥大细胞分数之间的相关性。

07 - 针对乳腺癌肺转移的药物再利用

        目前免疫检查点阻断（ICB）疗法主要针对PD-1/CTLA-4，它可以抑制负调控途径，将T细胞从衰竭状态中释放出来。然而，PD-1和CTLA-4的表达水平在无转移组和肺转移组之间未能有明显的差异（补充图S2）。利用上面确定的肺转移相关基因和CMAP扰动特征，对肺转移的CMAP药物进行了药物再利用。提出了前20种可能逆转乳腺癌肺转移特征的药物（图6），包括IGF-1抑制剂、mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、SRC抑制剂、aurora激酶抑制剂和JAK抑制剂。此外，还列出了FDA批准的针对肺转移相关IRG的药物。

图6 针对肺部转移的药物预测分析

四、结论

        目前的研究中，发现是否存在肺转移的患者之间的微环境和免疫组成是不同的。发生肺转移的乳腺肿瘤具有更积极的恶性行为，更严重的基因组不稳定性，更高的免疫原性，但对免疫细胞的效应功能表现出普遍的抑制。在免疫细胞中，肥大细胞的比例可以作为预测个体肺转移状态的指标。当肥大细胞含量低时，肿瘤更具侵略性，容易发生肺转移。