The activity of tumor-infiltrating T cells was evaluated by in vitro activation using PMA plus Ionomycin for 4 h.
PMA(佛波酯)和 Ionomycin(离子霉素)皆为体外培养试验中常用的两种刺激物。其中 PMA 为 PKC(蛋白激酶 C)的激活物，PKC 则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致许多蛋白的表达，进而引起 T 细胞的活化。在细胞内，PKC 可被 DAG(二脂酰甘油)和 Ca2+的共同作用而 激活，因此在 Ionomycin(Ca2+的转运剂，可将细胞器内的 Ca2+转运至胞浆内)的参与下，T 细胞内 PKC 可被进一步激活。
PKC属于下游的TCR信号，只会诱导T细胞活化和增殖，因此，PMA和Ionomycin的刺激后T细胞的活化和增殖能力改变，然而并不会改变T细胞的分化状态。
TCR信号是很强很基础的刺激，研究者更加倾向于认为所有的T细胞亚群在TCR信号刺激下的增殖速度是一致的，所以在在体外进行PMA和Ionomycin刺激后，仍然反映的是T细胞亚群在生物体体内的原始比例。
Proliferation was determined by CFSE dilution assay ，OT-I T cells were activated with 1 µg/ml OVA257-264 (SIINFEKL) peptides. CFSE dilution and intracellular staining were performed on day 2.
CFDA-SE是一种非极性分子,可自由穿透细胞膜并在细胞内被酯酶转化成带负电荷的并具有绿色荧光的氨基反应性羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)。CFSE是一种对细胞无毒性的染料,化学性质稳定。CFSE一旦进入细胞后不能从细胞中释出,并可自发不可逆地通过赖氨酸侧链或其他可利用的胺偶联到细胞蛋白质上,也不会被代谢降解。细胞中CFSE含量减少的唯一途径是通过细胞增殖分裂,细胞中所含的CFSE随细胞的增殖分裂进入子代细胞。因此,CFSE含量减少的细胞代表增殖的子代细胞。
无论是MTT比色法、3H-TdR掺入法,还是BrdU标记法,都只能对活细胞进行检测,忽视了某些细胞已经分裂又发生死亡的可能性;而使用CFSE标记,死亡的细胞将在几天内保持荧光强度基本不变,同时可使用其它染料将其区分开来,为增殖分析提供了更加全面的资料。
《CFSE标记技术及其在细胞研究中的应用进展》
the Heatmap GO analysis on the Metascape website (http://metascape.org) to find out the key regulators.
Each C57BL/6J mouse bearing B16-OVA tumors was injected i.v. with 250 µg of Ultra-LEAF™ purified mAb SA271G2 or PBS (negative control). To study the presence of B cells, blood was collected and stained with CD20 antibody.
B细胞清除：C57小鼠静脉注射250ug Ultra-LEAFTM Purified anti-mouse CD20 Antibody（Clone：SA271G2）或Ultra-LEAFTM Purified rat IgG2b, κ isotype control。7天之后处死小鼠，取脾脏，淋巴结，骨髓，腹腔灌洗液，并染色。
CD20是4A膜结构域（MS4A）家族的成员，与B细胞的跨膜钙流、激活和增殖有关。CD20最初表达于Pre-B细胞上，并且除了浆细胞以久，持续表达于B细胞分化的各个阶段。
B细胞清除策略是利用抗体药物靶向结合B细胞特异性抗原，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）或补体依赖的细胞毒性作用（Complement dependent cytotoxicity，CDC）介导B细胞裂解，从而清除B细胞，或者通过靶向B细胞存活需要的细胞因子，如B细胞激活因子（B-cell activation factor，BAFF）诱导B细胞凋亡，达到清除B细胞的目的。
Macrophages were depleted by i.v. application of clodronate liposomes (200 μl per mouse; YEASEN, Shanghai, China). The efficiency of macrophages depletion was evaluated using F4-80 antibody by flow cytometry.
氯膦酸二钠（Clodronate）是一种双膦酸盐药物，在临床上主要用于癌症引起的溶骨性骨转移、骨质疏松症和高钙血症。其作用机理是氯膦酸二钠在细胞内代谢成不可水解的ATP类似物，抑制线粒体中的ADP/ATP转运机制，从而阻断线粒体呼吸链诱导细胞凋亡。但是该药物亲脂性低，不能跨细胞转运，在口服或是静脉给予游离药物后，2小时后即可达半衰期，48小时内80%药物随尿液排出。
氯膦酸盐包裹进磷脂体的水相中形成氯膦酸盐脂质体(4°保存)，氯膦酸盐不能自由的通过脂质体磷脂体双分子层。注射到生物体内后，氯膦酸盐脂质体会被巨噬细胞吞噬，在巨噬细胞内的溶酶体磷酸酶的作用下，溶解在脂质体内的氯膦酸盐会被逐步释放出来并在细胞内积累，当达到一定浓度时，巨噬细胞将会受到不可逆损伤，诱发细胞凋亡。死亡细胞内的氯膦酸盐会被释放到细胞外，随尿液排出体外。
可以用于体外巨噬细胞的清除，但是这种方法比较适合体内实验。主要是由于在体外培养过程中，从死亡细胞释放的氯膦酸或者是从脂质体中“渗漏”出来氯膦酸，会一直存在于培养基中，但是在体内，氯膦酸的半衰期很短，很快就会被肾脏清除。虽然游离的氯膦酸不会进入细胞也不会进入脂质体，但是一旦他们在培养基中积累就会慢慢地进入细胞中。
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