hello，大家好，又是周一，新的开始，这一次我们继续分享DSP技术在疾病研究中的运用，参考文章在Spatial Analysis of Neural Cell Proteomic Profiles following Ischemic Stroke in Mice using High-Plex Digital Spatial Profiling，我们来看看DSP做了怎样的分析。
Abstract
中风被列为第五大死亡原因和成人残疾的主要原因。中风后神经元损伤的进展被认为是神经胶质、神经元和周围细胞外基质的复杂整合，因此潜在的治疗必须针对这些相互作用产生的有害影响。在这项研究中，利用Nanostring Digital Spatial Profiling (DSP) 技术检查了缺血性中风后早期发生的空间细胞和神经炎症机制。雄性 C57bl/6 小鼠接受光血栓形成大脑中动脉闭塞 (MCAO) 并在缺血后三天处死。根据感兴趣的区域研究同侧半球的空间区别：与对侧半球相比的缺血核心、梗塞周围组织和梗塞周围正常组织 (PiNT)。分析证明了同侧半球使用 DSP 技术启动了不同的空间调节蛋白质组学profiles，可以用免疫组织化学标记、FJB、GFAP 和 Iba-1 进行一致识别。核心边界轮廓证明了神经元死亡、细胞凋亡、自噬、免疫反应性和早期变性蛋白的诱导。最值得注意的是，核心边界导致神经元蛋白 Map2 和 NeuN 减少，自噬蛋白 BAG3 和 CTSD 增加，小胶质细胞和外周免疫侵袭蛋白 Iba1、CD45、CD11b 和 CD39 增加，以及增加在神经退行性蛋白 BACE1、APP、αβ 1-42、ApoE 和过度磷酸化的 tau 蛋白 S-199 中。梗死周围区域显示出星形胶质细胞免疫反应性、凋亡和神经退行性蛋白质组学特征增加，BAG3、GFAP 和过度磷酸化的 tau 蛋白 S-199 增加。与对侧皮层相比，PiNT 区域显示出最小的变化，仅增加了 GFAP。总体而言，数据结果强调了以空间方式识别缺血机制的重要性，以了解整个缺血进展和修复过程中复杂的动态相互作用，以及为成功的治疗干预引入潜在目标
Introduction
缺血性中风是导致严重长期残疾的主要原因，也是America第 5 大死亡原因。缺血性中风约占中风的 80%，表现为脑内动脉闭塞或阻塞。 目前，只有组织纤溶酶原激活剂 (tPA) 被批准用于治疗中风，但用于治疗的time window有限，仅给予 3-5% 的患者。然而，tPA 治疗不发挥神经保护作用，并且不是预防继发性、长期神经退行性损伤的理想选择。此外，由于中风进展被认为是神经胶质、神经元和周围细胞外基质的复杂整合，因此治疗应针对这些相互作用产生的不利影响。因此，迫切需要以空间方式了解缺血性中风后早期发生的细胞和分子机制，以便开发有效的缺血性中风治疗方法。
缺血性中风始于葡萄糖和氧气的损失，这会引发坏死性神经元死亡（梗塞）、氧自由基的释放、微血管损伤和缺血核心的血脑屏障破坏。然后，这会导致周围缺血半暗带中继发性凋亡、兴奋性神经元死亡，神经炎症增加，可在受伤后持续数天。缺血性损伤完成后，将神经元密度降低区域中剩余的可逆损伤细胞的边界区域定义为梗塞周围组织。梗塞周围区域在啮齿动物和人类的免疫细胞和神经元细胞之间表现出复杂的动态相互作用，这关键地决定了缺血后的晚期神经保护和修复过程。缺血后的神经炎症涉及小胶质细胞、星形胶质细胞的激活和外周白细胞的浸润。常驻小胶质细胞表现出与形态变化和渗透到核心的反应性。星形胶质细胞增殖并增加炎症因子的表达，如胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)，随后可导致沿梗死边界的星形胶质细胞瘢痕形成。随着梗死周围区域与核心病变的关系在空间上表现出不同的机制，这些相互作用变得更加复杂。核心区域表现出渐进性空洞，而梗塞周围组织变得越来越可塑性。因此，了解这些相互作用系统在缺血后以空间方式发展时的复杂性是进一步阐明未来预防和治疗潜在机制的关键。
Gene and protein profile expressions have often been analyzed after ischemic stroke to elucidate these mechanisms during various timepoints, but have been limited by technological challenges. 技术限制包括需要对组织进行切片分析，例如整个同侧和对侧半球。一些研究已经从每个半球仔细提取了皮质和皮质下层，并取得了more specific profile success。然而，这些不同区域缺血后发生机制的特定空间特征：缺血核心、梗塞周围和梗塞周围正常组织 (PiNT) 尚未得到如此详细的清楚阐明。在这项研究中，分析检查了由缺血引发的蛋白质谱的空间调节。通过利用免疫组织化学和Nanostring Digital Spatial Profiling (DSP)，分析了感兴趣区域中的蛋白质组，包括缺血后 3 天的缺血核心边界、梗塞周围和 PiNT，与对侧皮层中的区域相比。 NanoString 的 GeoMx DSP 技术使用高级空间分析为经验的蛋白质分析物生成分析数据，以快速、定量地评估组织样本内异质性的生物学影响。分析证明了同侧半球特别以一种空间方式启动了不同的蛋白质组调节profiles，可以与细胞标记物、fluoro Jade B (FJB)、GFAP 和 Iba-1 一致地共定位。此外，核心边界区域呈现出独特的蛋白质组学特征，代表神经元死亡、细胞凋亡、免疫反应性和早期变性。最值得注意的是，核心边界导致神经元蛋白 Map2 和 NeuN 减少，自噬蛋白 BAG3 和 CTSD 增加，小胶质细胞和外周免疫侵袭蛋白 Iba1、CD45、CD11b 和 CD39 增加，以及增加在神经退行性蛋白 BACE1、APP、αβ 1-42、ApoE 和过度磷酸化的 tau 蛋白 S-199 中。梗塞周围区域显示出星形胶质细胞免疫反应性、凋亡和神经退行性蛋白质组学特征增加，自噬蛋白 BAG3、GFAP 和过度磷酸化的 tau 蛋白 S-199 增加。与对侧皮层相比，PiNT 区域显示出最小的变化，仅增加了 GFAP。这些发现可能有助于确定治疗中风的新治疗策略。
Method（关注一下DSP和不同ROI的差异分析）
Nanostring Digital Spatial Profiling Analysis
为了使整个组织可视化，在 GeoMx DSP 仪器中，使用 MAP2、Iba-1 和 GFAP 的寡偶联抗体以及 Syto13（细胞核）对固定玻片进行染色。圆形几何图案（直径 200 μm）用于识别每个样本扫描组织上的六个 ROI：同侧和对侧半球上的核心边界、梗塞周围和 PiNT 区域。 GeoMx 神经细胞分析蛋白质组（73 种蛋白质）用于该分析。根据面板的 UV 可切割寡偶联抗体分配到每个 ROI 上，UV 切割掉，吸入板中，通过 GeoMx DSP 仪器进行杂交和计数。所有得到的空间量化分析都是在 Nanostring GeoMx DSP 分析软件中进行的。背景校正由蛋白质靶标相关图确定，并且在 Rb IgG、Rb IgGa 和 Rb IgGb 之间可见高相关性。所有三种 IgG 蛋白都用于通过信背景比进行面板背景校正。空间 ROI 使用线性混合模型 (LMM) 与 Bonferroni-Hochberg (BH) 校正和扫描 ID 和 ROI ID 的随机效应进行比较。通过比较 ROI/对侧 ROI 与 p 值 <0.05 的显著性来确定倍数变化。
Results
FluoroJadeB Identifies Ischemic Infarct 3 Days Post-MCAO
检查了在损伤后三天用神经变性染色剂 FJB 确定光血栓形成梗死的一致性和能力。 来自具有诱导 MCAO 的小鼠的脑组织在立体定位前囟+2 和 +1 的立体定位位置缺血后三天被处死并进行空间检查。 在整个梗塞核心中在前囟 +2 处始终发现可检测的 FJB+ 细胞，但在前囟 +1 处未发现
- 注：Neuronal Damage 3 Days Post-Ischemia. Brains from mice with induced MCAO were examined 3 days after ischemia. FJB+ cells were counted at bregma +2 and +1 at 5x magnification for whole infarct comparison. Extensive FJB+ staining was found at bregma +2 (a) but were not detected at bregma +1 (b). A mean value of FJB+ cells from three brain sections from each location was obtained for each individual mouse brain (c; p<0.01, n=4). Data are expressed as mean ± SD. Scale bar = 100 μm.
MCAO 脑组织在前囟 +2 处表现出平均 547.3 ± 114 个 FJB+ 细胞，在前囟 +1 处的平均值仅为 11.6 ± 19。 这表明发生了神经退行性损伤并且可以在 MCAO 三天后通过 FJB 染色检测到，原发性神经元损伤位于前囟+2。
GFAP Increases in Core Border 3 Days Post-Ischemia
为了表征 MCAO 后发生的早期炎症过程，使用免疫组织学标记物 GFAP 以空间方式评估星形胶质细胞免疫反应性。来自具有诱导 MCAO 和假对照 (SHAM) 的小鼠的脑组织被处死，并在缺血后三天在同侧核心、核心边界和 PiNT 内的同侧核心 +2、+1 和 0 处检查 GFAP 表达。在幼稚或假手术小鼠皮层中通常不会观察到高 GFAP 表达，但在神经元损伤后增殖和活化的星形胶质细胞中上调。因此，GFAP 表达被分析为对侧的平均灰度值倍数变化，以检测 GFAP 表达的区域变化。将 MCAO 动物中的 GFAP 区域倍数变化表达与 SHAM 动物进行比较。 GFAP 表达在同侧核心边界内在前囟 +2 和 +1 处显著增加，倍数变化分别为 1.76 ± 0.3 和 1.66 ± 0.29。在任何立体定位位置的同侧核心或 PiNT 区域中均未观察到 MCAO 和 SHAM 之间 GFAP 平均灰度值倍数变化的显著变化。此外，对于所有三个区域，GFAP 平均灰度变化表达与前囟 0 处的 SHAM 没有区别。 GFAP 表达表明，在缺血后三天，沿核心边界的星形胶质细胞炎症活动以空间方式增加。
- 注：GFAP Expression Increases in Core Border Spatially 3 Days Post-Ischemia. Brains from mice with induced photothrombotic MCAO were examined spatially 3 days after MCAO for GFAP expression. Mean gray value fold change of GFAP expression compared to the contralateral hemisphere in the ipsilateral core (a) ipsilateral core border (b) ipsilateral PiNT (c). Mean gray value fold change increased significantly in the core border at bregma +2 and bregma +1 but was non-significant in bregma 0 (d). Mean gray value fold change of GFAP was non-significant in ipsilateral core or PiNT in any stereotaxic location. Data are expressed as mean ± SD; p<0.05, MCAO (n=4) and SHAM (n=2). Scale bar = 100 μm.
Microglia Increase Reactivity Within Ischemic Region
为了进一步表征 MCAO 后发生的炎症过程，使用免疫组织学标记物 Iba-1 以空间方式评估小胶质细胞活性。来自诱导 MCAO 和 SHAM 手术的小鼠的脑组织被处死，并在缺血后三天在同侧核心、核心边界和 PiNT 内的前囟+2、+1 和 0 处进行空间检查，以检测 Iba-1 的表达。在 SHAM 小鼠皮层中，表达 Iba-1 的小胶质细胞表现出静止的分枝形态。缺血后，常驻小胶质细胞可以增加 Iba-1 反应性，改变形态，以及浸润的单核细胞会表达 Iba-1。将 Iba-1 表达分析为对侧的平均灰度值倍数变化和灰色最大值计数倍数变化，以检测 Iba-1 表达的区域变化。将 MCAO 动物中的 Iba-1 区域倍数变化和灰色最大值计数倍数变化与 SHAM 动物进行比较。 Iba-1 平均灰度值倍数变化在立体定位前囟+2 的核心区域内显著降低，倍数变化为 0.74 ± 0.09，与 SHAM 相比变化为 -1.3 倍。 Iba-1 灰色最大值计数在前囟 +2 的核心区域内也显著减少，倍数变化为 0.28 ± 0.2，与 SHAM 相比变化为 -3.6 倍。与前囟 0 的核心区域内的 SHAM 相比，Iba-1 灰色最大值计数倍数变化也表现出显著增加，倍数变化为 1.35 ± 0.2。免疫组织学图像显示了前囟 +2 核心区域内 Iba-1 表达细胞的明显形态变化。核心区域中心的 Iba-1 表达细胞也消失了，这可能反映在灰度值的减少中，特别是最大值计数。此外，表达 Iba-1 的圆形细胞沿着核心边界区域出现，并开始侵入核心，表明住宅小胶质细胞的激活和外周单核细胞的潜在早期入侵。
- 注： Iba-1 Expression Demonstrates Microglia Reactivity Spatially at 3 Days Post-Ischemia. Brains from mice with induced MCAO were examined spatially 3 days after ischemia for Iba-1 expression. Mean gray value fold change and gray maxima count fold change of Iba-1 expression compared to the contralateral hemisphere in the ipsilateral core (a) ipsilateral core border (b) and ipsilateral PiNT (c). Mean gray value (d) fold change decreased in core region at bregma +2 and increased in the core border at bregma +1. Mean gray value fold change of Iba-1 was non-significant in PiNT or in other regions of interest at any other stereotaxic location. Gray maxima count fold change of Iba-1 decreased in ipsilateral core region at bregma +2 but increased in the core region at bregma 0 and all stereotaxic ipsilateral core border regions (e). Gray maxima count fold change of Iba-1 was non-significantly different in PiNT at all stereotaxic locations. Data are expressed as mean ± SD; p<0.05, MCAO (n=4) and SHAM (n=2). Scale bar = 100 μm.
与 SHAM 相比，Iba-1 平均灰度值表达在前囟+1 的核心边界内略微增加，倍数变化为 1.09 ± 0.12。 Iba-1 灰色最大值计数倍数变化表明所有核心边界立体定位前囟位置的 Iba-1 计数显著增加。在前囟 +2、囟门 +1 和囟门 0 处核心边界内的 Iba-1 灰色最大值计数倍数变化分别为 1.71 ± 0.4、1.47 ± 0.2 和 1.1 ± 0.1。每个前囟核心边界位置内灰色最大值计数 Iba-1+ 圆形细胞的增加进一步表明，在缺血后三天，居住小胶质细胞的激活和外周单核细胞以空间方式早期侵入核心。在任何其他立体定位位置的同侧核心或核心边界区域中，没有观察到 MCAO 和 SHAM 之间的 Iba-1 平均灰度值倍数变化的显著变化。此外，在前囟 0 时，Iba-1 平均灰色折叠变化表达与 SHAM 没有区别。在任何立体定位位置的 PiNT 中，未观察到 Iba-1 灰色最大值计数倍数变化的显著变化。表达 GFAP 和 Iba-1 的星形胶质细胞和小胶质细胞的核心边界内的炎症激活证明了该区域在缺血后早期的重要性。因此，我们已经确定，在缺血后三天，可以通过结合这三种神经胶质细胞染色：FJB、GFAP 和 Iba-1，在组织学上确定核心边界的一致识别
- 注：Histological Markers Define Core Border at 3 Days Post-Ischemia. Immunohistology images of FJB (a; green), Iba-1 (b; red), and GFAP (c; red) compared at the core border at bregma +2 can define a consistent, clear core border at 3 days post-ischemia. Scale bar = 100 μm.
Nanostring Digital Spatial Profiling Defines Distinct MCAO Protein Profiles
为了阐明这些特定 ROI 内缺血后的详细蛋白质组学分析和概况，利用了 Nanostring 的 DSP 技术。 与对侧使用 Nanostring DSP 神经细胞分析蛋白面板（70 种蛋白质；不包括 IgG 阴性靶标 ）。 切片用四个选定的识别标记进行免疫染色，用于 ROI 选择。 标记物包括：用于神经元损伤的 MAP2、用于星形细胞反应性的 GFAP、用于小胶质细胞的 Iba-1 和用于细胞核的 Syto13。 在每个 ROI 上运行完整的神经细胞分析蛋白质面板，导致每个 ROI 的量化蛋白质read-outs。
- 注：Representative Immunohistochemical Figures for DSP Analysis and ROI
Selection. Coronal sections from mice with induced photothrombotic MCAO were
immunohistologically stained for identifying markers MAP2 (green), GFAP (yellow), Iba-1 (red), and Syto13 for nuclei (blue) (a) and overlayed for ROI selection (b). Overlay of these markers clearly identified the extent of the infarct region and astroglia immunoreactivity within the core border. ROI’s included ipsilateral core border, ipsilateral peri-infarct, ipsilateral PiNT, and contralateral cortex, each region is outlined in a red circle (c). Clear difference in the identifying IHC markers can be seen within each ROI.
为了确定 DSP 区域特定比较与全组织分析的比较意义，首先将 DSP 蛋白质组学概况作为组合同侧半球组与对侧半球蛋白质组数据进行比较。 所有同侧 ROI（核心边界、梗塞周围和 PiNT ROI）被组合为一个同侧半球组，并通过 LMM 与对侧比较显著变化的蛋白质。 然后，通过 LMM 将单个核心 ROI 与对侧的显著变化的蛋白质进行比较。 整个同侧半球组仅产生 4 种显著上调的蛋白质。 然而，当同侧核心边界 ROI 被隔离并与对侧组织进行比较时，27 种蛋白质表现出显著变化，其中 19 种上调，8 种下调。
- 注： Ischemia Presents Region Specific Proteomic Profiles. Volcano plots representing the significant protein fold changes of the Ipsilateral Hemispheric group (core border, peri-infarct, and PiNT ROIs) (a) and isolated core border ROI (b) compared against the contralateral ROI. Data is plotted on a -log10 pValue scale; fold change on the x-axis; all tags (blue plotted dots) represent individual panel proteins; p-value (0.05; green dotted x parallel line) (n=3).
为了确定生物样本之间 ROI 的蛋白质组学概况之间的一般相似性和一致性，创建了一个层次聚类。 总体而言，所有核心边界 ROI 聚集在一起，展示了核心边界内样本之间最相似的profiles。 梗塞周围 ROI 聚集在最靠近核心边界 ROI 的位置，表明梗塞周围区域内的样本与核心边界 ROI 旁边最近的蛋白质组学轮廓之间存在相似性。 PiNT 和对侧 ROI 通常在核心边界和梗塞周围区域之外聚集在一起，表明样本之间彼此最相似，与核心边界和梗塞周围区域最相似。 总的来说，这个层次聚类表明每个 ROI 组在缺血后都表现出独特的、一致的蛋白质组学特征。
- 注：Hierarchical Cluster Heat Map of ROIs. Protein expression from each individual ROI representing the ipsilateral core border (purple), ipsilateral peri infarct (orange), ipsilateral PiNT (red), and contralateral (white) is plotted on a heat map where red= higher representative expression and blue= lower representative expression. ROIs are clustered according to proteomic expression similarity where most similar are clustered together and tree relatives are mapped above.
与对侧 ROI 相比，每个 ROI 都得到了进一步的表征。每个 ROI 都记录了根据倍数变化显着差异调节的蛋白质。同侧核心边界 ROI 显示 27 种差异调节的蛋白质，其中 19 种上调，8 种下调。在这 27 种差异调节蛋白中，最显着的是反映在神经元死亡、凋亡、免疫反应和早期变性蛋白中的独特特征。神经元蛋白、MAP2 和 NeuN 分别导致核心边界中 -7.19 和 -3.07 的下调。自噬蛋白 BAG3 导致上调 12.04 倍，溶酶体自噬蛋白 CTSD 也上调 8.44 倍。星形胶质细胞蛋白 Aldh1/1 下调 -2.30 倍，胶质细胞骨架中间丝蛋白波形蛋白下调 -2.15 倍。许多与小胶质细胞免疫反应性和免疫外周侵袭相关的蛋白质在核心边界区域内显著上调。其中包括 CD45 上调 2.25 倍、Iba-1 上调 4.31 倍、CD11b 上调 8.24 倍、CD39 上调 8.74 倍和 MSR1 上调 9.69 倍。值得注意的是，SPP1 也有明显的 26.39 倍上调，SPP1 是一种与疾病相关的小胶质细胞特别相关的蛋白质。
在核心边界区域内，BACE1 上调 4.18 倍，APP 上调 5.41 倍，淀粉样蛋白 β (αβ) 1-42 上调 5.82 倍。这表明缺血三天后，BACE1 切割蛋白在核心内上调，可能导致 APP 和 αβ 1-42 形式的切割产物增加。值得注意的是，tau-S199 淀粉样蛋白显著上调了 57.42 倍，这会导致神经元不稳定和死亡。 ApoE 也显著上调了 6.02 倍，根据它是表达神经保护同种型 3 还是神经退行性同种型 4，这可能会导致神经保护或神经退行性变。同侧梗塞周围 ROI 显示 3 种蛋白质的显著上调： GFAP 上调 23.69 倍，tau-S199 上调 21.41 倍，BAG3 上调 2.96 倍。同侧 PiNT ROI 仅在一种蛋白质 GFAP 中表现出显著上调 6.09 倍
Discussion
提供的数据强调了在分析缺血后蛋白质组学数据时考虑空间差异的重要性。我们的蛋白质组学分析在空间和区域上呈现出与梗塞核心相关的独特特征。以前使用整个同侧组织的技术可以提供对缺血后发生机制的一些了解，但可能会极大地掩盖每个区域内发生的特定机制。我们的数据表明，用 DSP 分析的每个区域都显示出具有明显调节蛋白质的独特蛋白质组学特征。在缺血核心边界内，鉴定了与神经元死亡、细胞凋亡、免疫反应性和早期变性相关的独特特征。当进一步研究这些差异调节蛋白之间的关系时，出现了一种潜在的模式，未来对治疗靶向感兴趣。正如预期的那样，神经元蛋白 MAP2 和 NeuN 被下调，表明核心边界内的神经元死亡。这也反映在自噬蛋白 BAG3 和溶酶体自噬蛋白 CTSD 的上调中。 CTSD 已被证明在缺血后会急剧增加，但会随着溶酶体破裂而减少。 BAG3 在梗塞周围区域内也被上调，表明自噬和相关细胞凋亡可能仍在该区域内进行。
缺血还导致一般免疫细胞表面标志物 CD45 以及 Iba-1 的上调。 这表明住宅小胶质细胞和/或外周单核细胞浸润和活性增加。 然而，由于住宅小胶质细胞被认为通过变性在核心内急剧减少，这反映在免疫组织化学平均灰度值和灰色最大值计数倍数变化中，我们预计这种 Iba-1 增加反映了外周单核细胞的侵袭。 CD11b 和 CD39 的 8 倍上调以及 CD39 受体 P2RX7 的 3 倍上调也表明了这一点，它们都是白细胞的表面标志物。 注意到白细胞早在缺血后 12 小时就开始浸润到缺血区域并持续存在，在缺血后 7 天达到峰值水平。众所周知，缺血后的小胶质细胞反应性具有有益和有害的影响。急性激活的小胶质细胞可以吞噬在病变核心内坏死的细胞，防止神经毒性产物的进一步释放。然而，活化的小胶质细胞也会释放许多促炎细胞因子和活性氧，这有助于梗塞的发展。因此，真正了解这些细胞因子和蛋白质的相互作用是确定未来治疗干预目标的关键。例如，CD39 和 MSR1 都表现出大约 9 倍的上调，并且两种蛋白质都被建议在炎症过程中发挥神经保护作用。过表达 CD39 的转基因小鼠品系导致白细胞浸润减少、梗塞体积减小、缺血后神经功能缺损减少，表明 CD39 在缺血损伤期间具有神经保护作用。建议内皮细胞和白细胞上的 CD39 表达通过缺血后的细胞间相互作用减少炎症细胞运输和血小板反应性。此外，已经表明 MSR1 蛋白的更高表达通过 MSR1 诱导的神经炎症消退增加了缺血后受损相关分子模式 (DAMP) 的清除，表明 MSR1 是潜在的治疗靶点。此外，蛋白质 SPP1 有显著的 57 倍上调。这种蛋白质被认为是一种促血管生成营养因子，但它也与神经变性有关，因为它被记录为在衰老的小胶质细胞中以年龄依赖性方式上调。有争议的是，这种蛋白质也与巨噬细胞通讯相关，星形胶质细胞向梗死区域迁移，这被认为是缺血后早期缺血神经血管细胞的神经保护修复机制。
每个区域都有一个独特的星形细胞蛋白质组学特征。在核心边界内，星形胶质细胞蛋白、Aldh1/1 和波形蛋白下调约 2 倍。已证明表达波形蛋白的星形胶质细胞在缺血后急剧增加，但在这三天的时间点下调与 Aldh1/1 下调相结合，可能表明核心内的星形胶质细胞变性。然而，梗塞周围区域内 GFAP 的大量上调几乎 24 倍，并且在前囟 +2 和 +1 处核心边界处的平均灰度值倍数变化增加证实表明边界内和梗塞周围的星形胶质细胞具有强反应性局部缺血后三天。多项研究表明，早在缺血后 4 小时直至 28 天，GFAP 在梗死周围区域内特异性增加。星形胶质细胞和小胶质细胞的反应性可导致继发性组织损伤、渐进性空洞和沿梗死周围边界的瘢痕形成。最终，核心边界和梗塞周围区域内这些小胶质细胞和星形胶质细胞蛋白质组学特征之间的相对差异可以为预防继发性损伤和抗炎提供潜在目标。
众所周知，缺血与神经变性有关，更具体地说，与中风史、tau 蛋白和阿尔茨海默病患病率增加之间的关系有关。核心边界区域内的多个 tau 相关蛋白产生的模式最终可能表明未来的治疗目标。 BACE1、APP 和 αβ 1-42 在核心边界内都表现出大约 5 倍的上调。已显示 BACE1 响应于缺血后释放的活性氧和缺氧诱导因子 1α (HIF1α) 而上调。 BACE1 活性的增加导致 APP 的裂解增加，并增加了淀粉样蛋白 β 的神经毒性形式 αβ 1-42 的沉积和聚集。发现 BACE1 表达受 APP 上 γ-和 β-分泌酶裂解之间的正反馈回路调节。此外，神经元、星形胶质细胞或小胶质细胞内 APP 的上调可导致神经元不稳定和易受压力影响，这表明所有核心边界内的三种蛋白质可能表明神经退行性特征。还发现 tau-S199 形式在核心边界内高度上调 57 倍，并且这种 tau 形式已被证明在缺血后阿尔茨海默样病变的发展中起作用。缺血后，tau 蛋白急剧地迅速去磷酸化，然后缓慢地再磷酸化并以丝氨酸位点特异性方式积累。据报道，Tau-S199 在缺血后被特异性诱导并导致缺血性神经元损伤。缺血后 tau 蛋白的失调和置换被认为有助于神经退行性特征。最后，核心边界区域内蛋白质 ApoE 的上调可以发挥双重作用，具体取决于正在表达的 ApoE 同种型。 ApoEε3 是最常见的同种型，可以通过促进从小胶质细胞到神经元的通信以进行修复、再生和存活以及抑制小胶质细胞反应性，从而表现出神经保护作用。然而，ApoEε4 亚型可能通过促进 αβ 沉积而导致神经退行性变。
Conclusion
分离同侧核心边界、同侧梗塞周围、同侧 PiNT 和对侧皮层区域并以如此详细的方式比较它们的蛋白质组学特征的能力使我们能够确定每个区域都表现出独特的差异调节蛋白质组学特征。 未来的缺血研究可以从空间分析中受益匪浅，因为我们已经证明了全组织分析可能会导致数据大量丢失。 总的来说，我们的数据强调了识别缺血空间机制的重要性，以了解整个缺血进展和修复过程中复杂的动态相互作用，以及为成功的缺血治疗干预引入潜在目标。
生活很好，有你更好
