hello，大家好，又到周五，一周的收官之间，今天我们要继续分享DSP在研究中的运用，在这之前呢，文章空间转录组检测靶点定量技术----Digital Spatial Profiler（DSP）介绍了DSP的基本原理和运用场景，文章DSP（Digital Spatial Profiler,数字空间技术）在新冠中的运用（本来想发简书的，但是简书直接就封了这篇文章，不知道为什么）介绍了一些DSP在新冠研究中的运用，而今天，我们来个简单的，看看DSP在Collapsing glomerulopathy中的运用，今天分享的文章在Digital Spatial Profiling of Collapsing Glomerulopathy，用法相对简单明了的文章，帮助我们由浅入深的认识这项空间转录组技术。

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好了，我们好好分享一下吧

ABSTRACT

塌陷性肾小球病是局灶性和节段性肾小球硬化的一种组织学上不同的变体，表现为大量蛋白尿并预示着预后不良。塌陷性肾小球病可由病毒感染（例如 HIV 和 SARS-CoV-2）引发。塌陷性肾小球病灶的转录分析很困难，因为只有少数肾小球可能在肾活检中表现出这种组织学，而导致这种异质性的机制尚不清楚。因此，作者使用了最近开发的数字空间分析 (DSP) 技术，该技术允许在单个肾小球水平上对 mRNA 进行量化。使用 DSP，分析了来自 HIV 和 SARS-CoV-2 感染患者的肾小球中的 1,852 个转录本，这些患者的活检证实为塌陷性肾小球病。 DSP 分辨率的提高揭示了肾小球转录谱的异质性，这些异质性在混合肾小球的早期激光捕获显微解剖研究中被遗漏。使用免疫组织化学和 RNA 原位杂交的重点验证显示出与 DSP 结果的良好一致性。因此，DSP 代表了一种强大的方法来剖析病理上可辨别的肾脏病变的转录程序。

INTRODUCTION

塌陷性肾小球病是局灶节段性肾小球硬化 (FSGS) 的一种独特的组织学模式。其特征是毛细血管簇塌陷、上皮细胞肥大/增殖，以及足细胞足突的广泛消失。 塌陷性肾小球病被认为是 FSGS 最具侵袭性的形式，与导致终末期肾病的进行性实质损伤有关。众所周知，塌陷性肾小球病与滥用药物、双膦酸盐、高干扰素状态（丙型肝炎治疗、狼疮）和病毒相关感染（细小病毒 B19、HIV、SARS-CoV-2）。 具有高风险 APOL1 基因型的个体特别容易发生塌陷性肾小球病，这反映了遗传易感性和外源性触发因素之间的相互作用。

鉴于其罕见性和肾活检中塌陷性病变的局灶性，很难研究驱动这种独特肾小球病的分子机制。 一项开创性的激光捕获显微解剖和基于微阵列的转录组学研究证明了 FSGS 和特发性塌陷性肾小球病中发育程序的激活。最近的一项激光捕获显微解剖和蛋白质组学研究确定了特发性塌陷性肾小球病中细胞外基质 (ECM) 成分的变化。这两项研究都需要汇集来自多个切片的组织学正常和塌陷的肾小球，以获得足够的材料进行检测。 合并排除了比较个体肾小球之间的基因表达，干扰了将变化分配给受影响的与不显着的肾小球的能力，并掩盖了肾小球的异质性。

由于苛刻的样本要求，使用激光捕获显微切割方法无法在塌陷性肾小球病活检中获得个体肾小球转录谱。 然而，空间转录组学的技术进步现在允许准确测量基因表达和定位到定义的解剖结构。 其中一项技术 NanoString 的 GeoMx 数字空间分析 (DSP) 平台与福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织材料兼容，并允许自由选择解剖结构。 从单个 4μm 厚的切片（30-50 个细胞）中所需的 8-10,000μm² 的最小捕获面积非常适合分析通常直径为 200μm 且具有≥100 个细胞/肾小球横截面的肾小球。

由于与其他病因相比，尚不清楚病毒介导的塌陷性肾小球病是否是一种普遍机制，因此使用基因表达的数字空间分析探索了在 SARS-CoV-2 和 HIV 相关塌陷性肾小球病中驱动类似形态学表现的分子机制。 这项对个体肾小球中基因表达的研究提供了对塌陷性肾小球病发病机制的新见解，以及即使在形态学上难以区分的肾小球中也存在分子异质性。

RESULTS

研究确定了三名分别患有 HIV 相关和 SARS-CoV-2 相关塌陷性肾小球病的患者。 通过光学显微镜检查，两组患者的具有塌陷特征的肾小球在组织学上似乎相似。 一名 COVID-19 患者 (COVID3) 患有明显的血栓性微血管病 (TMA)，其中多个肾小球含有血栓，其他患者则表现出缺血性变化。

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• 注：Representative Jones-stained sections of glomeruli with histology analyzed by digital spatial profiling. HIVAN – HIV associated nephropathy; CG – collapsing glomerulopathy; COVID – SARS-CoV-2 associated disease; TMA – thrombotic microangiopathy。

切片与癌症转录组图谱探针（1,827 个基因 + 27 个刺突插入以检测 SARS-CoV-2 病毒序列和对病毒进入和繁殖很重要的宿主基因）杂交，并用标记物复染以检测细胞核、平滑肌肌动蛋白 (SMA)、 泛细胞角蛋白和白细胞 (CD45)

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• 注：Biopsy sections were immunostained with fluorescent antibodies against the indicated markers and free from regions of interest (ROI) were drawn around glomeruli of interest. Bound probes were released and quantified by next generation sequencing.

在自由形式的感兴趣区域 (ROI) 中选择单个肾小球，并与它们在琼斯染色切片上的组织学相关联。 不幸的是，由于组织折叠，具有塌陷特征的肾小球无法用于 COVID3 患者。 对于每个肾小球 ROI，使用紫外线照射释放与结合探针相关联的寡核苷酸条形码并收集以实现高通量测序。 在第三个四分位数 (Q3) 标准化后，在每个患者的个体肾小球水平上生成表达谱。

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• 注：1852 genes (rows) were quantified from each glomerulus (columns) from n=3 patients each from normal, HIVAN and COVID conditions.

主成分分析证明了疾病和组织学的差异，以及来自 3 个正常对照的所有肾小球的表达特征的紧密聚类

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• 注：Principal component analysis reveals tight clustering of normal glomerular transcriptome profiles from 3 patients but large differences amongst glomeruli from HIVAN and COVID patients. For each glomerulus the first number indicates the patient and the second, the glomerular ID for that patient. Glomeruli with features of collapsing glomerulopathy are indicated in bold italics.

来自患有 TMA 的 COVID3 患者的肾小球表现明显，并在所有后续分析中单独考虑。 这些结果证明了对与组织学相关的个体肾小球进行空间registered的转录组学分析的可行性。

接下来，研究DSP 数据与需要汇集肾小球的激光捕获显微切割数据相比如何。 利用个体肾小球水平的 DSP 数据，首先研究了哪些基因表达差异表征了具有塌陷组织学的肾小球，而不管其病因如何。 将 7 个具有塌陷特征的肾小球的表达谱与来自 3 个正常对照的 12 个肾小球进行了比较。 这确定了 209 个基因的表达水平变化 >1.5 倍，参数方差分析 p<0.05。

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• 注：Volcano plot showing genes with differential expression between glomeruli with collapsing features and glomeruli from normal patient controls. Parametric ANOVA p<0.05 and absolute fold change of >1.5-fold were used to identify genes of interest.

这些差异表达的基因丰富了肾脏发育和形态发生ontologies

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• 注：Gene ontology enrichment identifies significant changes in biological processes related to kidney development, morphogenesis and VEGF signaling in collapsing glomerulopathy。

这些丰富的ontologies与之前的激光捕获显微解剖和基于微阵列的塌陷性肾小球病研究相关，并且两项研究之间差异表达的基因有很好的重叠

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• 注：Dotplots of gene expression for selected genes. Each dot represents an individual glomerulus classified according to histology. For all comparisons between collapsing and normal glomeruli, parametric ANOVA p<0.05.

CD24、CDH2 和 PAX8 等共享差异表达基因在萎缩的肾小球中增加

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• 注：Comparison of our results to a previous transcriptomic study of collapsing glomerulopathy identifies several shared gene signatures. Differences between the studies likely reflect different sensitivities/dynamic ranges of the techniques or dilutional effects in the prior study which pooled all glomeruli from patients with a diagnosis of collapsing glomerulopathy whether they had collapsing features or not. Expression of genes highlighted in boldface are shown in panel C

CD24 是一种祖细胞标记物，已在人类塌陷性肾小球病中得到验证。CD44 和 PAX8 在 FSGS 的动物模型中增加，但尚未在人塌陷性肾小球病中得到证实。有趣的是，在我们的研究中，许多差异表达的基因在具有塌陷形态的肾小球中减少，并且以前没有报道过。我们发现 DSP 数据中 WT1、CDKN1C 和 MME (CD10) 等足细胞基因的表达降低，但在先前的激光捕获显微解剖研究中没有显着变化，这可能是由于合并塌陷和正常肾小球导致的信号稀释形态学。参与内皮稳态的基因（ERG、VEGF、KDR、FLT1）在两种类型的塌陷性肾小球病中也减少。在我们的研究中，有丝分裂标志物 MKI67 和 PCNA 在萎缩的肾小球中均显着增加，但变化 <1.5 倍。足细胞表型标志物的丢失和增殖标志物的增加与之前关于塌陷性肾小球病中足细胞表型失调的报告一致。为了定位肾小球内特定细胞类型的表达变化，我们验证了 PAX8 和 MME 在其他部分的表达和定位我们的样品。在患有 TMA 的 COVID3 患者的正常肾脏样本和肾小球中，PAX8 在鲍曼囊内壁上皮细胞和肾小管上皮细胞（均被排除在我们的 DSP ROI 选择之外）中显示出强烈的核表达，但在肾小球簇上的细胞中没有。相比之下，塌陷的肾小球在大多数覆盖塌陷的毛细血管簇的反应性上皮细胞中表现出强烈的 PAX8 表达，以及在单个足细胞和鲍曼囊内壁上皮细胞中的零星表达。

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• 注：Immunohistochemistry for PAX8 and MME validates the glomerular expression profiles of collapsing glomerulopathy shown in panel C.

与具有 TMA 的 COVID3 患者和正常对照相比，MME 显示出相反的模式，塌陷肾小球中的表达降低。 这可能代表足细胞中的表达降低或足细胞本身的丢失/转分化。 因此，个体肾小球水平谱揭示了塌陷肾小球中的转录异质性和新的差异表达基因，然后通过免疫组织化学检测蛋白质进行验证

为了了解 HIV 和 SARS-CoV-2 是否以相似或不同的方式影响肾小球，我们比较了 3 名 HIV 感染患者的 12 个肾小球与 COVID1 和 COVID2 患者的 6 个肾小球的表达谱（再次排除了患有 TMA 的 COVID3 患者） . 这确定了 58 个基因的表达水平变化 >1.5 倍，参数方差分析 p<0.05

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• 注：Volcano plot showing genes with differential expression between glomeruli from patients with HIVAN or COVID-19 (n=3 patients each). Parametric ANOVA p<0.05 and absolute fold change of >1.5-fold were used to identify genes of interest.

值得注意的是，在所有检查的肾小球中均未检测到 SARS-CoV-2 病毒 RNA，并且在所有 3 次 COVID-19 活检中，SAR-CoV-2 刺突蛋白的 ISH 均为阴性，这一发现与最近的尸检肾脏 DSP 研究一致 .与抗病毒反应和干扰素通路相关的基因ontologies在 HIV 患者的肾小球中高度富集 。

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• 注：Gene ontology enrichment identifies significant changes in biological processes related to anti-viral responses and interferon signaling in glomeruli from HIVAN patients.

有趣的是，当按组织学分类时，很明显，来自 HIV 感染患者的萎缩性肾小球和组织学上正常的肾小球都表现出强烈的干扰素反应特征

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• 注：Dotplots of gene expression for selected genes. Each dot represents an individual glomerulus classified according to histology. For all comparisons except KRT19, parametric ANOVA p<0.05.

我们之前的分析已将 KRT19 鉴定为在萎缩性肾小球中上调的基因。然而，对 COVID 和 HIV 塌陷性肾小球的检查表明，这仅是由 HIV 感染患者的塌陷性肾小球驱动的。 这些增加的 KRT19 表达水平与泛细胞角蛋白免疫荧光在 ROI 选择过程中作为复染剂的相关性很好

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因此，即使 HIVAN 和 COVID-19 患者的活检结果在形态学上相似，DSP 也揭示了在 HIVAN 和 COVID-19 中差异调节的分子途径。

塌陷性肾小球病也可以在血管内皮损伤（血栓性微血管病，TMA）的情况下检测到，例如在接受 VEGFA 阻断剂治疗癌症的患者中。 TMA 和塌陷性肾小球病也与 COVID-19 肾损伤有关，如 患者 COVID3 的病例，但其潜在机制知之甚少。因此，我们研究了来自具有 TMA 的 COVID3 患者的 6 个肾小球与 12 个正常肾小球的表达谱。 在该分析中，182 个基因的表达水平变化 >1.5 倍，参数方差分析 p<0.05

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• 注：Volcano plot showing genes with differential expression between glomeruli from the patient with COVID-TMA (patient 3, n=6 glomeruli) compared to 3 normal patients’ glomeruli (n=12 glomeruli). Parametric ANOVA p<0.05 and absolute fold change of >1.5-fold were used to identify genes of interest.

这些基因丰富了与代谢、跨膜转运、组织重塑和血管生成相关的ontologies

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• 注：Gene ontology enrichment identifies significant changes in biological processes related to metabolism, transporters and angiogenesis in the COVID-TMA glomeruli.

引人注目的是，来自患有 TMA 的 COVID3 患者的肾小球中的几个对血管功能很重要的基因增加

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• 注： Dotplots of gene expression for selected genes. Each dot represents an individual glomerulus classified according to histology. For all comparisons of COVID-TMA to normal glomeruli, parametric ANOVA p<0.05. Glomeruli from other patients/histologic profiles are included for completeness

这些包括粘附分子 VE-钙粘蛋白 (CDH5)25 和 PECAM1 (CD31)、血管生成素信号受体 TIE1、Notch 信号组分 DLL4 和 NOTCH1，以及早期应激反应性 AP-1 转录因子组分 JUNB。与 TMA 相关的缺血性损伤一致 , 缺氧反应基因 DDIT4、HIF1A 和 VEGFA 也被诱导。 根据肾小球组织学分类的 VEGFA 表达模式particularly striking.。 为了进一步研究这一点，我们在患者活组织检查的其他组织切片中对 VEGFA 进行了 RNA 原位杂交 (RNAISH)

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• 注： RNA in situ hybridization of VEGFA confirms its digital spatial expression profile shown in panel C.

正常肾小球对 VEGFA mRNA 显示出强健的足细胞染色。 相比之下，来自 HIV 患者的萎缩肾小球显示几乎完全丧失 VEGFA 染色。 Unfortunately，从 COVID 患者活检获得的更深层次中不存在塌陷的肾小球。 在来自 HIV 和 COVID 患者的非塌陷肾小球中，VEGFA 水平似乎也较低。 相比之下，患有 TMA 的 COVID3 患者的肾小球表现出强烈的足细胞 VEGFA 染色。 这些 RNA-ISH 表达模式证实了通过空间分析得出的个体肾小球表达模式，并确定了复杂的足细胞/内皮相关表达程序，该程序随肾小球组织学的不同而变化。

DISCUSSION

在这项研究中，我们成功证明了 DSP 在了解 HIV 和 SARS-CoV-2 相关塌陷性肾小球病和 TMA 方面的可行性。与之前仅检查特发性塌陷性肾小球病的研究相比，我们在此描述了与病毒感染相关的塌陷性肾小球病的表达谱。我们将使用 DSP 的结果与使用激光捕获显微切割的先前研究进行了比较，并确认塌陷性肾小球病具有独特的表达谱发育调节基因和 ECM 重塑基因的表达增加。然而，当根据组织学或疾病状态对肾小球进行分层时，DSP 增加的敏感性和肾小球水平分辨率有助于识别表达谱的差异。例如，来自 HIV 感染患者的肾小球表现出强烈的干扰素反应特征，而这在 COVID-19 患者的肾小球中不存在。这是令人惊讶的，因为我们和其他人已经提出与 COVID-19 相关的塌陷性肾小球病是在具有高风险 APOL1 基因型的个体中旺盛的细胞因子反应的背景下发生的。这种差异可能反映了 2/3 的 HIV 中持续的病毒感染患者，而 2/3 的 COVID-19 患者的感染已清除。与 HIV 直接感染肾细胞的报道类似，证实 SARS-CoV-2 直接感染肾脏也存在争议。我们没有通过空间分析或 RNA 在我们的任何样本中检测到 SARS-CoV-2 病毒 RNA -ISH。活检中缺乏 SARS-CoV-2 感染的证据支持间接损伤模型，但不排除先前短暂感染的可能性（“肇事逃逸”模型）。我们还在 TMA 中发现了明显的血管损伤特征，之前没有描述过。 HIV 和 COVID-19 患者的萎缩性肾小球几乎完全丧失了 VEGFA，这可能代表基因下调和/或足细胞丧失。然而，来自患有 TMA 的 COVID3 患者的肾小球显示出 VEGFA 和其他内皮细胞相关转录物的表达增加，这在以前从未被描述过，并且可能代表对血管损伤的适应性反应。

研究的主要局限是样本数量少；然而，这是研究罕见疾病（例如塌陷性肾小球病）所固有的。为了进行比较，即使是拥有超过 2,100 个患者数据集的大型数据库 Nephroseq，也只有 6 名患有塌陷性肾小球病的患者的表达数据，与我们的研究中的数字相同。此外，使用激光捕获显微切割技术无法将单个肾小球的组织学与其表达谱相关联，这是 Nephroseq 数据集中最常用的方法。另一个缺点是在我们进行这项研究时可用的癌症转录组图谱探针组中可用的基因数量很少（1,825 个癌症和免疫学重点基因）。从那时起，一个包含约 18,000 个蛋白质编码基因的全转录组图谱探针集已经发布，这将使肾活检中疾病过程的全转录组分析成为可能。我们研究的其他局限性包括，如果肾小球没有在用于 RNA-ISH 或免疫组织化学的更深层次上保存，则验证失败，以及难以确定因果关系和机制的时间，这在所有基于人体活检的研究中都很常见。然而，即使有这些限制，我们还是通过使用 DSP 的疾病和组织学发现了肾小球表达模式的显着异质性。重要的是，我们发现 DSP 和 RNA-ISH 以及由免疫荧光/免疫组织化学确定的蛋白质水平之间存在良好的相关性，验证了这项新技术及其在提供对组织疾病病理生理学的新见解方面的效用。

最强大的是，DSP 技术足够灵敏，可以对具有少量肾小球的 FFPE 组织的单个切片进行研究，并且不需要合并，从而在任何临床或研究活检中实现单肾小球水平分辨率数据。这对于罕见的疾病过程或仅有肾脏结构局灶性受累的疾病尤其有用，例如塌陷性肾小球病。在这些情况下，为了满足基于激光捕获显微切割的分析的最低输入要求而汇集大量结构会掩盖潜在的表达模式，正如我们在本研究中所展示的那样。 DSP 基于探针的 mRNA 定量的另一个优势是与 FFPE 临床档案标本的单部分兼容。相比之下，激光捕获显微切割需要更高的 RNA 输入完整性，并且优先对来自同意专门为这些研究进行额外研究活组织检查的患者的前瞻性收集和稳定样本进行。

基因表达的空间解析分析代表了范式转换技术的最新迭代，该技术有望彻底改变我们对疾病机制的理解。新兴的空间转录组学方法，利用广泛可用的下一代测序仪，在简化的工作流程中量化应用于载玻片的组织切片的转录本。 最近，DSP 已应用于 COVID-19 尸检肾组织，但据所知，这项研究代表了该技术首次应用于肾活检组织中的肾小球。 在这项研究中，DSP 揭示了 HIV 和 SARS-CoV-2 驱动的塌陷性肾小球病和 TMA 的肾小球异质性和共享和不同的病理途径。 这开启了使用存档 FFPE 标本深入了解使用人体活检组织的各种解剖学定义的肾脏疾病机制的令人兴奋的可能性。

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• 注： Histology of glomeruli selected for digital spatial profiling. For each glomerulus the first number indicates the patient and the second, the glomerular ID for that patient. Glomeruli with features of collapsing glomerulopathy are indicated in bold italics and a blue bounding box. Attempts were made to identify glomeruli on original 2μm thick Jones-stained sections. When this was not possible, the glomeruli were imaged from the slide used to generate spatial profiling data that was post-stained with Jones. Apparent differences in appearance/quality may be due to the fact that these sections were cut at 4μm and have been processed previously for digital spatial profiling.

Method

Spatial profiling, sequencing and data analysis

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比较简单的DSP运用的文章，初步认识DSP技术的特点。

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