一篇生信家族的文章比较重要的一步是家族成员的确定，所有基本分析和进化分析都是基于此。
前面推文提到本人的参考物种是模式植物拟南芥，因此我首先下载了很多关于拟南芥的综述类和研究类的文献，了解其基因家族甚至某些基因具体的功能分析（这对后期写文章的前言和讨论很重要）。除了参考的物种，了解其他物种的此类基因家族分析也很有必要（万一不凑巧被人做了，也没有继续做的必要了）。我的研究物种是栽培花生，就找了水稻，棉花，小麦和油菜等作物此类基因家族的生信分析文章，其次找了园艺作物，如桃子、葡萄和柚子等，最新的文章在栓皮栎等木本植物中也有了生信的分析报道。（文献查找用的较多的NCBI的Pubmed，知网，Sci-hub……）
阅读完相关文献后就开始家族成员的确定。主要分为三个步骤A：研究物种栽培花生所有的蛋白序列。B：参考物种拟南芥该基因家族的蛋白序列。C：双向Blast确定候选基因家族序列。
A： 栽培花生的基因组文件（fasta格式）和基因注释文件（gtf/gff3）。（基因组和注释文件参考发表文章对应的链接，比较靠谱；或者特定物种的网站如拟南芥的TAIR，当然需要自己比对选择高质量及组装较好的基因组。2个准备文件完成后，第一步是蛋白序列的整理与提取；第二步是将所有CDS翻译为蛋白序列。
一：蛋白序列的整理与提取（TBtools软件一直更新，相关功能所在模块可能改变，自行摸索）
（1）Sequence Toolkit→Fasta Tools→Fasta Stats（可以看到基因组的一些基本信息：总长度，染色体数量）
（2）Sequence Toolkit→GFF3/GTF Manipulate→GXF Sequence Extract→拖入基因注释文件和基因组文件并设置输出文件路径，同时设置Feature Tag和Feature ID为CDS和Parent
二：将所有CDS翻译为蛋白序列
Sequence Toolkit→ORF Prediction→Batch Tanslate CDS to Protein
研究物种所有的蛋白序列已准备好，需要参考物种该基因家族的蛋白序列，进行双向Blast，从而初步得到研究物种的基因家族成员序列。
B：本人的参考物种拟南芥该基因家族分析已十分详细，因此去TAIR将该基因家族所有的蛋白序列直接下载（格式一定要是Fasta格式，若不是，也可以用TBtools软件相关模块进行转换。如果不对，后续比较分析会有各种小问题产生）。
C：BLAST→BLAST GUI Wrapper→Two Sequences Files→拖入参考序列基因家族成员的蛋白序列和研究物种的所有蛋白序列，并设置输出文件路径，同时设置Outfit为table格式（其他参数可以根据需要自己改或不改，而且比对时间根据物种的基因组大小有所不同，记得我的电脑跑过夜了）。
ABC结束算是最初的研究物种基因家族成员已经确定了，但还需要后续的反复筛选与确定。主要分为三个步骤：D：统计候选基因的基本信息。E：人工手动筛选。F：上传序列至NCBI batch CDD/hmmer/pfam基于保守结构域进行筛选确定。
D：Sequence Toolkit→Fasta Tools→Fasta Stats（可以看到候选序列的数量，后期筛选去掉一些，符合本人研究物种的估算，之前提取数量高达1 000多直接放弃了，这一步需要自己多比对确认）。
E：因为研究物种和基因家族本身的特征，本人基于前人对该家族的研究手动去除了一些重复的、长度较短的、不符合特征的序列。
F：人工筛选去除部分后，将其余序列上传至NCBI batch CDD/hmmer/pfam筛选确定。
（百度→bing→Bach cdd比较快，网站预测最好提供邮箱，结果一般可保存7-14天，适合数量较大的基因家族）。
DEF最终得到所有候选基因序列，再与之前所查阅的文献比对，大致可以确定（后续基本性质分析也可再进行个别的调整确认）。
