2021/4/16
Springer : Methods in Molecular Biology系列书籍
《Deep Sequencing Data Analysis》2013
chapter 1 ：
An Introduction to High-Throughput Sequencing Experiments: Design and
Bioinformatics Analysis
1、设计高通量测序实验的步骤
2、介绍了最广泛使用的应用，并描述了基本的测序概念。
3、可用于生物信息学分析的各种软件程序，以理解测序数据。
一、高通量测序中的基本概念
1、Insert：用于测序的DNA片段
2、Read：Insert被测序到的部分
3、Single Read（SR）：一种只从Insert序列一端测序的测序程序
4、Pair Read（PR）：一种从Insert序列两端测序的测序程序
5、Flowcell：连接DNA芯片并进行测序的一种小玻璃芯片。Flowcell被探针覆盖，允许与DNA片段连接的接头杂交。
6、Lane：Flowcell由8个物理分离的通道组成，称为Lane。在所有Lane上并行进行测序。
7、Multiplexing/Demultiplexing：在同一Lane上对几个样本进行测序称为多路复用Multiplexing，在一条Lane上测序的Reads的分离称为分路复用Demultiplexing，通过一个识别每个Reads*的索引将其与已知样本的索引进行比较。
8、Pipeline：一系列的计算过程
二、高通量测序应用程序（部分）
（一）reading
1、Resequencing：在一个给定的样本中找到相对于参考基因组的变体
实验细节：从相关细胞中提取DNA，进行由DNA碎片化和测序组成的样品制备
基本分析总结：将序列片段映射到参考基因组，并通过总结片段与其基因组位点的差
异来识别相对于参考基因组的变异对应的“地图”
2、Target-enriched sequencing：靶点富集测序是一种特定的Resequencing形式，只
关注特定的基因组基因座。
实验细节：在从细胞中提取DNA并进行样品制备后，进行一个富集过程来捕获相关的
位点，靶富集可以使用“定制的”靶富集探针在基因组的特定区域进行，或
使用可用的试剂盒，如exome-enrichment kits。
基本分析总结：与Resequencing相同
3、De novo assembly：识别一个基因组序列，而无需任何额外的参考
实验细节：与Resequencing相同
基本分析总结：组装过程依赖于DNA片段的重叠。这些重叠被合并成一致序列，称为
contigs和 scaffolds。
（二）counting
1、ChIP-Seq/RIP-Seq：找到RNA或DNA结合蛋白的结合位置
实验细节：（1）首先，进行了ChIP/RIP实验：蛋白质与DNA/RNA结合，并与之交
联。然后DNA/RNA被分裂。
（2）蛋白质pull down经历免疫沉淀过程，交联被逆转
（3）对富集于蛋白结合位点中的DNA/RNA片段进行测序
基本分析总结：被序列排列的片段被映射到基因组中。基因组中丰富的位置是通过检
测基因组的映射片段的“peaks(峰)”发现的,这些峰值应该明显高于在
周围的位点中已映射的片段，并且与对照样本相比要高得多----通常
是ChIP实验的输入DNA或其他由非特异性抗体进行的免疫沉淀样
本。
2、RNA-Seq：检测和比较基因表达水平
实验细节：从细胞中提取总RNA，在样品制备过程中，mRNA被pull down并破碎。
然后，mRNA片段被逆转录成cDNA，cDNA片段测序。
基本分析总结：cDNA片段被映射到参考基因组中。映射到每个基因的片段被计数和
标准化，以便比较不同的基因和不同的样本。在一个RNA-Seq实验
中，通过检测映射到一个未注释区域的基因组上的片段束，可以找到
未标记的基因和转录本。
（三）reading/counting
microRNA-Seq：检测和计数microRNAs
实验细节：从细胞中提取总RNA，通过识别大多数已知的microRNA分子共同的自然
结构来分离microRNA，然后对microRNA片段进行逆转录和测序。
基本分析总结：被测序的片段被映射到基因组中，然后，微RNA可以被检测和计数。
三、序列覆盖范围 Sequence Coverage
1、在reading中，覆盖范围对应于平均覆盖基因组中每个碱基的reads数量。
一般来说，30X覆盖率被认为是识别基因组变异的最小值，而de novo通常需要一个更高的覆盖范围。
2、在counting中，覆盖的概念并不简单，因为the number of reads along the genome is not expected to be uniform.
可帮助评估是否有足够的reads序列的分析是“*saturation report*(饱和度报告)”，使用所有的reads确定表达水平，表达水平与取一部分reads重新计算的表达水平比较。
高度表达的基因甚至饱和了10%的读数，即使有完整的数据集，低表达的基因仍然不饱和
四、测序配方: Single-Read vs. Paired-End, Insert Size, and Read Length
1、基因组的重复性
要唯一地对重复区域的read映射进行评分，它必须 比重复区域或边界相邻的非重复序列更长。更长的reads或PE reads允许“拯救”非唯一端，也映射到基因组中的非唯一区域。
2、差异剪接变异
同一基因表达的转录本不同时：
3、测序样本与参考基因组的遗传距离
如果被测序的样本与参考基因组有遗传距离，可能需要更长的reads来确定基因组中每个read的来源。
4、寻找结构变异
基因组的结构变化，如长的插入或缺失，倒位和易位可以通过Paired-End信息找到。
5、De Novo 装配
挑战：测序错误、低复杂度区域和重复区域等
更长的PE reads会导致更好的装配，使用一些具有不同insert length的序列库可以改进组装过程。
五、测序的样本数
1、 Resequencing：有遗传距离。。。
2、RNA-Seq：使用来自不同重复的数据，并将其合并为一个具有更高统计显著性的值。
3、ChIP-Seq：+控制样本
六、分析管道
1、Raw Data 处理
此步骤的可用软件：Illumina’s CASAVA software，Illumina运行会生成“base-calling”文件(*.bcl)，它们只有在转换为通用fastq格式时才会非常有用,在此文件转换过程中，还执行解复用过程，即从同一lane上排序的不同样本分离读取。
2、质量控制和read操作
此步骤的可用软件：CASAVA和FastQC
测序运行完成后，在开始分析之前，应检查运行的质量是否以下参数，这些参数可能说明样品和运行的质量。
3、为De Novo Assembly组装 Contigs 和 Scaffolds
此步骤的可用软件：SOAPdenovo，ABySS，Velvet，ALL-PATHS
4、mapping
此步骤的可用软件：BWA ，Bowtie，TopHat
5、 Variant Calling and Filtering
此步骤的可用软件： SAMtools，GATK，MAQ
帮助检测变异的两个基本参数如下：
（1）Coverage at the loci
（2）被测序的等位基因的频率
6、Assembling Transcripts
7、 Gene Expression Analysis
此步骤的可用软件：Cufflinks，Myrna
一种常见的归一化方法FPKM，计算如下：
8、 Peak Detection
此步骤的可用软件：MACS，SICER
