A 目的
直接观察外泌体
B 适用范围
全标本包埋外泌体
C 材料与方法1
材料和仪器
100,000 × g exosome沉淀 或 富集的冰冻外泌体
2% or 4% (w/v) PFA
PBS
1% 戊二醛
草酸双氧铀, pH 7
甲基纤维素-UA, pH 4: 9份2% 甲基纤维素 +1份4%乙酸双氧铀，用前混合
Formvar-carbon载样铜网
封口膜
5号镊子
玻璃培养皿
不锈钢环，比铜网略大
1号滤纸
铜网储存盒
透射电镜
方法
将exosome固定在载样铜网上######
- 重悬100,000 × g离心的exosome沉淀到50-100 μl 2% PFA
如果是富集的冰冻exosome，融化并与等量 4%PFA混合
注：2% PFA中的exosome可在4℃储存一周 - 将5 μl exosome悬液加到Formvar-carbon载样铜网上。每份exosome样品准备2-3个铜网。盖上盖子，在干燥环境中让 Formvar膜吸收20min
*注：也可将5到10 μl exosome悬液滴加到封口膜上，将铜网Formvar膜面朝下放在悬液上 - 将100μl PBS加到封口膜上。用镊子将铜网 (Formvar膜面朝下) 放在PBS液滴上清洗
重要:在所有步骤中，都应保持Formvar膜面湿润，而另一面干燥.
注：相同样品的铜网可在同一PBS液滴中清洗 - 将铜网放在 50μl 1% 戊二醛液滴上 5 min.
- 将铜网放在 100μl ddH2O 2 min（洗8次）
反差增强及包埋样本######
- 将铜网放在50μl草酸双氧铀液滴上 pH 7, 5 min
- 将铜网放在50甲基纤维素-UA液滴上 10 min，冰上操作
- 用不锈钢环移开铜网，在滤纸上轻轻吸去多余液体，留下一薄层甲基纤维素膜
应将甲基纤维素膜的厚度控制在适当范围，这会影响到影像的对比度。不锈钢环被固定在1ml蓝枪头上 - 铜网仍在不锈钢环上，空气中干燥5到10 min
干燥后, 蓝-金色的干涉条纹说明甲基纤维素膜厚度合适、均匀 - 将铜网处在在盒子里
- 80 kV下拍摄电镜照片.
*注：电镜下，负染exosome显示为50-90 nm杯状膜泡。10-20 nm的脂质颗粒也常会被观察到。exosomes的形态可能被样品制备过程所影响。未发表的论文观察到冷冻电镜下exosome的形态较圆
Figure 1. TEM下exosome形态。箭头示exosome，三角形示脂质颗粒
Ref:
1: Current Protocols in Cell Biology
