A 目的
鉴定外泌体的纯化
B 材料与方法
a. Western Blot
同Western Blot， 使用还原性LB
b. 流式细胞术
需与磁珠/胶体珠偶联（如Dynabeads® magnetic beads），其余同流式细胞术
c. 胶体金标记免疫电镜
材料
100,000 × g exosome沉淀
2% or 4% (w/v) PFA
PBS
PBS/50 mM 甘氨酸 或 PBS/50 mM NH4Cl
封闭液: PBS/5% (w/v) BSA, PBS/10% (v/v) FBS, 或 PBS/1% (w/v) 冷鱼皮明胶 (CFG; Sigma Aldrich)
一抗
抗体稀释液
洗液: PBS/0.1% (w/v) BSA, PBS/0.1% (v/v) FBS, 或 PBS/0.1% (w/v) CFG
二抗
PBS/0.5% (w/v) BSA
蛋白A–金偶联物 (Cell Microscopy Center, Utrecht, The Netherlands)
1% 戊二醛
Formvar-carbon载样铜网
封口膜
5号镊子
电镜样品制备材料
方法
将exosome固定在载样铜网上
同电镜样品制备
封闭抗原
- 将铜网放在PBS上洗2 * 3 min.
- 将铜网放在PBS/50 mM 甘氨酸 洗 4 * 3 min
*注：甘氨酸会耗尽游离醛基。 可使用 50 mM NH4Cl替代 - 将铜网放在封闭液上 10 min
孵育抗体
- 将铜网放在 5μl 一抗稀释液上 30 min
注：一抗浓度 2 to 20 μg/ml，需测试 - 将铜网放在洗液上洗 6 * 3 min
- (可选): 封闭液中孵育二抗 30 min
- 将铜网放在100 μl 封闭液中洗6 * 3 min.
标记蛋白A–金偶联物
- 将铜网放在 5μl 蛋白A–金偶联物（稀释在封闭液中）20 min.
注：使用Dako二抗时推荐 1:200 的胶体金比例 - 将铜网放在 100 μl PBS洗8 * 2 min
- 将铜网放在 50 μl 1% 戊二醛 5 min
- 将铜网放在 100 μl 双蒸水中洗8 * 2 min
电镜样品准备
同电镜样品准备
Figure 1. exosome免疫电镜
C 鉴定外泌体的最低标准
至少三种蛋白存在（Table 1 第1,2 组，经典蛋白见Figure 1），Table1 第3组蛋白不存在。透射电镜/原子力显微镜观察形态，测量大小。
Table 1. Different categories of proteins and their expected presence in EV isolates, including some examples (non-exclusive)
| 1. Transmembrane or lipid-bound extracellular proteins | 2. Cytosolic proteins | 3. Intracellular proteins | 4. Extracellular proteins |
|---|---|---|---|
| 验证膜结构的存在 </br> 在EVs/exosome中富集 | 具有膜/受体结合能力 </br> 在EVs/exosome中富集 | 在膜结构/内含体中不存在的蛋白 </br> 在exosome中不存在/低表达，在一些类型的EVs中表达 | 特异/非特异性地与膜结构结合，与exosome一起分离出来 </br> 与exosome的关系多样 |
| 1. Tetraspanins (CD9, CD63, CD81) </br> 2. Integrins (ITG or cell adhesion molecules (CAM) </br> 3. Growth factor receptors </br> 4. Heterotrimeric G proteins (GNA) </br> 5. Phosphatidylserine-binding MFGE8/lactadherin | 1. Endosome or membrane-binding proteins (TSG101, annexins, Rabs) </br> 2. Signal transduction or scaffolding proteins (syntenin) | 1. Endoplasmic reticulum (Grp94, calnexin) </br> 2. Golgi (GM130) </br> 3. Mitochondria (cytochrome C) </br> 4. Nucleus (histones) </br> 5. Argonaute/RISC complex (AGO) | 1. Acetylcholinesterase (ACHE) </br> 2. Serum albumin </br> 3. Extracellular matrix (fibronectin, collagen) </br> 4. Soluble secreted proteins (cytokines, growth factors, matrix metalloproteinases) |
| 至少存在一种 | 至少存在一种 | 不存在 | 非必须 |
Figure 2. 常用外泌体marker
