日常瞎掰
目前，普通RNA-seq测序已经成为科研中一件非常稀松平常的事，这也是得益于其物美价廉的基础。虽然已经有不少成熟的RNA-seq分析流程存在，但并没有形成一个统一的标准答案。毕竟，条条大路通罗马，走哪一条都可以得到想要的结果，这也无伤大雅。就拿我们今天要说的RNA-seq的标准化方法来说就不止一种，可供选择的方式就有CPM、TPM、FPKM三种。当然，今天我们并不是要讨论哪一种方式更好，而是想跟大家分享一个好用的工具来快速进行标准化。rnanorm是一个基于python开发的命令行工具，可以很方便地来做以上三种方式的标准化操作。
安装
python包的安装方式，很简单，一行命令即可实现：
pip install rnanorm
使用
- 正常情况
正常情况下，表达矩阵里面的基因名通常使用GTF里面的symobol、ensembl原始ID命名，这样最方便的方式就是我们给软件两个参数：原始矩阵和GTF文件即可：
head readcount.txt
FEATURE_ID sampleA1 sampleA2 sampleA3 sampleB1 sampleB2 sampleB3
ENSMUSG00000000001.1 4248 6254 3409 7387 8099 3804
ENSMUSG00000000003.15 0 0 5 0 0 0
ENSMUSG00000000028.15 2239 3068 1801 2581 3081 1466
ENSMUSG00000000031.16 0 0 0 3 0 0
ENSMUSG00000000037.17 57 67 79 1 2 0
ENSMUSG00000000049.11 0 0 0 0 6 0
rnanorm readcount.txt --annotation gencode.vM25.annotation.gtf --gene-id-attr gene_id --tpm-output sample.tpm.txt
示例指定的是TPM方式，如果想要CPM、FPKM的结果可以分别使用参数--cpm-output、--fpkm-output来指定。这三个参数并不冲突，可以同时指定，得到三种标准化结果。
- 其他情况
有些时候，我们拿到的矩阵里面基因的名称可能不是原始的ID，如下面所示，虽然知道使用的是ensembl，但并不是GTF里面原始的ID。因为去除了ID点后面的后缀，所以即使提供了GTF文件，软件也是没法完成矩阵标准化。
TPM、FPKM标准化的操作，除了矩阵以外，其实另外还需要每个基因的长度信息，提供GTF文件就是为了获取这个信息。对于提供基因长度，也可以使用软件--gene-lengths来提供。像下面这样基因ID与GTF中不完全一致的情况，要么把矩阵里面基因ID转化成与GTF一致后再用上面的命令做标准化，要么提供一个基因长度的两列表格使用下面的命令来标准化。
head readcount.txt
FEATURE_ID sampleA1 sampleA2 sampleA3 sampleB1 sampleB2 sampleB3
ENSMUSG00000000001 4248 6254 3409 7387 8099 3804
ENSMUSG00000000003 0 0 5 0 0 0
ENSMUSG00000000028 2239 3068 1801 2581 3081 1466
ENSMUSG00000000031 0 0 0 3 0 0
ENSMUSG00000000037 57 67 79 1 2 0
ENSMUSG00000000049 0 0 0 0 6 0
awk -F '[\t"]' -v OFS="\t" 'BEGIN{print"FEATURE_ID","GENE_LENGTHS"}/^chr/&&$3=="gene"{len=$5-$4+1;print substr($10,1,18),len}' gencode.vM25.annotation.gtf >mm10.genelen.vM25.txt
head mm10.genelen.vM25.txt
FEATURE_ID GENE_LENGTHS
ENSMUSG00000102693 1070
ENSMUSG00000064842 110
ENSMUSG00000051951 465598
ENSMUSG00000102851 480
ENSMUSG00000103377 2819
ENSMUSG00000104017 2233
rnanorm readcount.txt --gene-lengths=mm10.genelen.vM25.txt --tpm-output=readcount.tpm.txt
如果想要的标准化方式是CPM，可以忽略--annotation或者--gene-lengths参数，直接提供原始矩阵即可。
结束语
从上面的示例可以看出使用rnanorm做标准化还是很方便的，不过有一些注意事项还是需要指出的：表达矩阵的基因那一列的列名必须为FEATURE_ID；提供GTF文件时，需要使用--gene-id-attr参数来指定基因ID的属性名，如示例矩阵中基因名为ensembl，则其在GTF中对应的ID属性为gene_id，如果是symbol的话就要换成gene_name；提供基因长度文件时，两个列名需为FEATURE_ID、GENE_LENGTHS。当然，CPM、TPM、FPKM标准化并不难，知道了方法自己完全可以写个函数来计算，但既然有了现成好用的工具，直接使用岂不是更省事省力！为软件作者口头点个赞！
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