不管在RNA-seq还是ChIP-seq分析中，都涉及到一个概念，就是标准化。
作为一个刚入门的小白，总是听王院长和其他熟悉生信分析的同学们强调标准化的重要性。

为什么说它重要呢？
因为测序读出来的reads落在一个基因内的counts数目取决于基因长度和测序深度。如果一个基因越长，测序深度越高，那么落在其内部的read counts数目就会相对越多。所以在多个样本（不同细胞系条件、不同组织、不同器官、不同个体等等等）中比较某一个基因的表达量，如果不进行数据标准化，比较结果是没有意义的。所以你拿到比对出来的read count是不能直接使用的！（https://www.cnblogs.com/beckygogogo/p/9270698.html）

既然这么重要，所以这个标准化到底是个什么鬼？
简单地说：标准化的对象就是基因长度与测序深度。（https://vip.biotrainee.com/d/63-rpkm-fpkm-rpm-tpm）我在网上搜索了很多关于标准化的教程，这时我才发现学好数学的重要性。。。我是一看到公式就头大啊！！！不管多么简单的公式，都会让我瞬间上头。。。

那么目前有几种标准化的方法？
目前有这么几种标准化方法：RPKM,FPKM,RPM,TPM

First of all：
在使用这几种方法之前，你都需要拿到一个东西：就是read count矩阵。
什么是read count? 答：高通量测序中比对到转录本/基因组上的reads数。（这个在我之前写的几个实战的文章里有提到）

下面就来具体的了解一下几种标准化方法：

(1)RPKM:
Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads
(每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)，主要用来对单端测序（single-end RNA-seq）进行定量的方法。
RPKM(软件:Range) 的计算公式：
RPKM= total exon reads/ (mapped reads (Millions) × exon length(KB))
total exon reads：某个样本mapping到特定基因的外显子上的所有的reads。
mapped reads ( Millions ) :某个样本的所有reads总和。
exon length( KB )：某个基因的长度（外显子的长度的总和，以KB为单位）。
优点：tophat-cufflinks流程固定，应用范围广。理论上，可弥补reads Count的缺点，消除样本间和基因间差异。（https://www.jianshu.com/p/c25e84383ae3）

比如现在有3个样品，4个不同的基因，1、2、3样本的总reads数分别是35，45，106。每个基因的read count如下图所示：

乍一看上去好像read count数差异还挺大的，但是不要高兴的太早。。。我们需要先进行标准化分析。根据公式：RPKM= total exon reads/ (mapped reads (Millions) ×exon length(KB))
我们可以计算每一个样品的RPKM，比如样品一的RPKM=10/（35×2）=1.43，其他的同理 ：

现在可以看出，虽然我们拿到的read count值不一样，但是经过标准化以后，这几个基因在3个样品的表达量实际上是差不多的。

（2）FPKM
全称：Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)，主要是针对pair-end测序表达量进行计算。
FPKM (软件：cufflinks)。公式与RPKM一致的。两种计算方法唯一的区别就是：
一个是fragment，一个是read。

如果是PE(Pair-end)测序，每个fragments会有两个reads，FPKM只计算这一对reads能比对到同一个转录本的fragments数量；而RPKM计算的是可以比对到转录本的reads数量，它不管PE的两个reads是否能比对到同一个转录本上。所以，如果是SE(single-end)测序，那么FPKM和RPKM计算的结果将是一致的。（https://www.jianshu.com/p/35e861b76486）

（3）RPM
Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads).
RPM的计算公式：
RPM=(total exon reads×10^6) / mapped reads (Millions)
total exon reads：某个样本mapping到特定基因的外显子上的所有的reads；
mapped reads (Millions) :某个样本的所有reads总和；
优点：利于进行样本间比较。根据比对到基因组上的总reads count，进行标准化。即：不论比对到基因组上的总reads count是多少，都将总reads count标准化为10^6。
缺点：未消除exon长度造成的表达差异，难以进行样本内exon差异表达的比较。
参考文章：关于readsCount、RPKM/FPKM、RPM、TPM的理解

（4）TPM
Transcripts Per Kilobase of exonmodel per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)，是一种优化后的RPKM，用于同一物种不同组织的比较。（https://zhuanlan.zhihu.com/p/37196518）
TPM (软件：RSEM) 的计算公式：
TPMi={( Ni/Li )*1000000 } / sum( Ni/Li+……..+ Nm/Lm )

Ni：mapping到某个基因上的read数；
Li：某个基因的外显子长度的总和。

在一个样本中一个基因的TPM：先对每个基因的read数用基因的长度进行校正，之后再用校正后的这个基因read数(Ni/Li)与校正后的这个样本的所有read数（sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)）求商。由此可知，TPM概括了基因的长度、表达量和基因数目。TPM可以用于同一物种不同组织间的比较，因为sum值总是唯一的。（https://zhuanlan.zhihu.com/p/37196518）
优点：首先消除exon长度造成的差异，随后消除样本间测序总reads count不同造成的差异。
缺点：因为不是采用比对到基因组上的总reads count，所以特殊情况下不够准确。例如：某突变体对exon造成整体影响时，难以找出差异。
这里有一个例子可以比较容易理解：TPM值就是RPKM的百分比嘛！(转自生信菜鸟团）

这些方法的区别是什么？
FPKM/RPKM：先按列（也就是这个样本的总read数）进行标化，之后再对对个基因的长度进行标准化。
TPM：先对基因长度进行标准化，之后再对列（这个时候就不再是这个样本的总read数了）进行标化。这样使得最终的TPM矩阵的每列都相同（列和都等于1），也就是说每个样本中的TPM的和都是一样的。这样就会使得我们更容易去比较同一个基因在不同样本中所占的read数的比例。而RPKM/FPKM由于最终的表达值矩阵的列和不同，故而不能直接比较同一个基因在不同样本中所占的read数的比例。
参考文章：
RNA-Seq数据标准化方法

哪一种方法适合我的数据分析？
说了那么多，好像每一个看起来都还可以，但是不知道在什么条件下用哪一个方法。这篇文章：RNA-Seq数据标准化方法 是这样说的：
1.学术界已经不再推荐RPKM、FPKM；（但实际上还是有很多人在用的。。。）那么为什么说RPKM和FPKM是错的呢？而又为什么目前很多人都还在用？这里的一篇文章写的非常清楚，非常深奥，写了一大堆公式！！！为什么说FPKM和RPKM都错了？ 这篇文章的详细分析过程我没看，真的是心有余而力不足啊。。。但是结论还是看得懂的。
2.比较基因的表达丰度，例如哪个基因在哪个组织里高表达，用TPM做均一化处理；
3.不同组间比较，找差异基因，先得到read counts，然后用DESeq2或edgeR，做均一化和差异基因筛选；如果对比某个基因的KO组和对照，推荐DESeq2。DESeq2和edgeR不用RPKM/FPKM或TPM做均一化，而是直接用原始的read counts做均一化处理。（这里要多说一句：是王院长说的：如果你的RNA-seq没有生物学重复，也就是说每一种处理就一个样品，那就不能用DESeq2来做标准化，要用DESeq做。）
4.如果组间RNA成分差异较大，例如liver跟spleen比，组织特异性表达基因在里面捣乱；再例如常见的某个基因KO组与对照相比，该基因成分在KO组里缺失。就用edgeR/DESeq2作均一化。

下面是我最近在重复一篇文章的分析时遇到的问题：没有生物学重复的RNA-seq怎么分析？？？
我在之前的RNA-seq分析练习的文章里用到了DESeq2进行read count的标准化，也试过single-end和pair-end的reads分析。但是前两天我在试着重复“Targeting super-enhancer-associated oncogenes in oesophageal squamous cell carcinoma”文章里RNA-seq的部分的时候（这篇文章的ChIP-seq分析部分见https://www.jianshu.com/p/05aae63d7c52），发现这篇文章里的RNA-seq数据没有生物学重复！！！
这个就比较郁闷了，因为我之前用的DESeq2在分析时，在构建矩阵的时候需要输入replicates的read count文件。据王院长说，没有生物学重复的RNA-seq在做标准化的时候，就不能用DESeq2，而是要用DESeq。另外我又在网上查阅了一些资料：
在3个生物学重复不同处理下，如何筛选差异基因
简单使用DESeq2/EdgeR做差异分析
简单使用DESeq做差异分析
readbio/DESeq.R
这些文章都表示：对于没有生物学重复的RNA-seq分析，需要用DESeq标准化。

下面是我的代码：

#导入表达矩阵
>mycounts <- read.csv("/media/yanfang/FYWD/RNA_seq/matrix/KYSE510_treatment_readcount_unnorm.csv")
>head(mycounts)
>rownames(mycounts)<-mycounts[,1]
>mycounts_withoutx<-mycounts[,-1]
>head(mycounts_withoutx)

#利用DESeq进行标准化
>library(DESeq)
>count<-data.frame(row.names=colnames(mycounts_withoutx),condition = c("KYSE510_0hr","KYSE510_2hr","KYSE510_4hr","KYSE510_6hr","KYSE510_12hr"),libType  =  c("pair-end","pair-end","pair-end","pair-end","pair-end"));
>condition = count$condition;condition;
>cds  =  newCountDataSet(mycounts_withoutx,condition);
>cds  =  estimateSizeFactors(cds);
>sizeFactors(cds);

### This step is telling the DESeq you don't have replicates. 
#Note the option sharingMode="fit-only". Remember that the default, sharingMode="maximum", takes care of
#outliers, i.e., genes with dispersion much larger than the fitted values. Without replicates, we cannot catch such
#outliers and so have to disable this functionality.
>cds  =  estimateDispersions(cds ,method="blind",sharingMode="fit-only")

#提取处理2小时样品与对照样品的标准化后的数据，这里conditionA设置为0小时处理，conditionB设置为2小时处理样品
>res_2h = nbinomTest(cds,"KYSE510_0hr", "KYSE510_2hr")
>write.table(res_2h, "KYSE510_2h_vs_0h.res", append = FALSE, quote = FALSE, sep = "\t")

#提取处理4小时样品与对照样品的标准化后的数据
>THZ1_4h_vs_0h = nbinomTest(cds,"KYSE510_0hr", "KYSE510_4hr")
>write.table(THZ1_4h_vs_0h, "KYSE510_4h_vs_0h.res", append = FALSE, quote = FALSE, sep = "\t")

#提取处理6小时样品与对照样品的标准化后的数据
>THZ1_6h_vs_0h = nbinomTest(cds,"KYSE510_0hr", "KYSE510_6hr")
>write.table(THZ1_6h_vs_0h, "KYSE510_6h_vs_0h.res", append = FALSE, quote = FALSE, sep = "\t")

#提取处理12小时样品与对照样品的标准化后的数据
>THZ1_12h_vs_0h = nbinomTest(cds,"KYSE510_0hr", "KYSE510_12hr")
>write.table(THZ1_12h_vs_0h, "KYSE510_12h_vs_0h.res", append = FALSE, quote = FALSE, sep = "\t")

输出的是csv文件，打开之后是这样的：

> a<- read.table("KYSE510_2h_vs_0h.res",sep="\t",header=T)
> head(a)
               id     baseMean    baseMeanA baseMeanB foldChange log2FoldChange      pval padj
1 ENSG00000000003 1403.3666530 1292.5892915 1514.1440  1.1714038      0.2282385 0.8127726    1
2 ENSG00000000005    0.0000000    0.0000000    0.0000         NA             NA        NA   NA
3 ENSG00000000419 1559.1391516 1717.4263314 1400.8520  0.8156693     -0.2939437 0.7601109    1
4 ENSG00000000457  507.8739093  624.6008395  391.1470  0.6262351     -0.6752237 0.4944952    1
5 ENSG00000000460  946.8086288 1018.7049871  874.9123  0.8588475     -0.2195260 0.8212624    1
6 ENSG00000000938    0.4519543    0.9039086    0.0000  0.0000000           -Inf 0.9919796    1

我查了网上对baseMean,baseMeanA和baseMeanB的解释：
(http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=23204)
baseMean mean normalised counts, averaged over all samples from both conditions.
baseMeanA mean normalised counts from condition A.
baseMeanB mean normalised counts from condition B.
以上就是无生物学重复的标准化过程。