翻译是非常重要的生物学过程，为了获取核糖体瞬时的翻译状态，需要获取其翻译的“足迹”信息。

核糖体足迹（Ribosome footprints）定义：

mRNA fragments of ~30 nucleotides that result from nuclease treatment of translating ribosomes. These are mRNA regions that are protected by the ribosome as the mRNA is decoded to a protein sequence.

核糖体蛋白结构

翻译是非常重要的生物学过程，该过程中核糖体以某一mRNA为模板来指导蛋白质的合成。研究表明，翻译障碍会导致多种疾病的发生，如神经退性、贫血和发育异常等。尽管核糖体的功能和结构已经比较清楚，然而翻译的调控机制知之甚少。

尽管人们知道翻译调控是一种重要的且决定蛋白表达的调控步骤，但是早前检测全基因组表达通常集中于检测mRNA的表达水平（如芯片或RNA-seq）。长期以来，精确检测翻译的过程比检测mRNA的水平面临的挑战多得多。然鹅，核小体印记的方法给人们带来了希望。

核糖体印记是基于深测序的方法，能够在全基因组范围内检测翻译的调控细节。该方法的核心是：一个正在翻译的核糖体坚强的保护着从核酸酶酶切的mRNA的~ 30nt的核苷酸。对这些核糖体保护的片段进行测序，即核糖体印记，从而对瞬时记录了核糖体的位置精确。

（1） 评估上述核糖体保护片段的密度可以获取特定转录本的蛋白合成速率。

（2） 此外，确定片段的位置可以获取翻译产物的身份（例如：转录从哪里开始，到哪里终止，甚至是哪些读码框框进行了翻译）。

（3） 通过该途径已经发现了许多新转录本或蛋白产物变体。

（4） 核糖体印记的分布规律可以进一步研究翻译调控的机制（例如：用于鉴定调节性翻译暂停和翻译的上游开发阅读框（upstream open reading frames，uORFs））。

（5） 核糖体印记技术可监控由核糖体亚基调节的翻译过程。

总之，该技术可以得知什么正在发生翻译（What）；翻译是如何被调控的（How）；细胞内翻译相关蛋白位于哪里（Where）。

一、何谓核糖体图谱

核糖体图谱（Ribosome Profiling）采用经典的核糖体印记（Ribosome Footprinting）分子技术，该方法借助核酸酶破坏掉没有被核糖体保护的翻译后mRNA中的区域。这种处理保留了约~30核苷酸长度的‘footprints’，这些足迹信息能够回帖到最初的mRNA，从而确定正在翻译的核糖体的精确位置。核糖体图谱扩展了该方法，通过回帖和衡量全部核糖体足迹信息来确定新蛋白的合成和对编码区域进行注释。

ribosome profiling和mRNA-seq对比示意图如下：

An overview of ribosome profiling

结合测序展现出的强大优势是：可用于获取全部翻译中的核小体的信息。例如，哺乳动物细胞中，编码约20,000个蛋白，其mRNA编码区域长度平均约为500个核苷酸，核酸酶切割所有的翻译中的核糖体-mRNA复合体，产生了10M的footprints。结合二代测序可产生数十亿的reads，能够实现核糖体足迹信息的可靠定量。总之，该技术可以作为mRNA-seq的一个重要的补充。

整合蛋白合成速率和mRNA的丰度能够评估各个mRNA的翻译效率。

二、核糖体图谱的优点

1） 定量敏感、精确

2）位置信息准确

3）瞬时检测

定性和定量

三、核糖体图谱的局限性

1）实验引入的数据失真

核糖体图谱技术的关键是迅速的抑制翻译来瞬时捕获核糖体的状态。

2）推断蛋白合成速率

mRNA完成翻译后才能真正的实现翻译速率的测量，而实际上只是检测了mRNA上的平均核糖体密度。

3）footprint-size片段的污染

非编码RNA或核糖核蛋白的污染对核糖体数据带来干扰。

4）比对-模棱两可的reads

模棱两可的reads不能确定该reads的来源，长reads和双端reads有助于减少模棱两可的比对。

5）样本数目

目前，核糖体图谱所需要的样本输入量高于mRNA-seq，不能用于单细胞研究。

参考资料

Gloria A. Brar and Jonathan S. Weissman. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. NATURE REVIEWS, 2015.