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1. NETs are involved in atrial fibrillation
Fig 1a-b： 作者首先取了AF和窦性节律(SR)患者的外周血，通过elisa检测了外周血NTs的含量（可以同时测MPO和dsDNA的elisa盒子）。结果显示AF患者外周血NETs显著更高，左心耳(left atrial appendages)匀浆的NETs检测得到了一致的趋势。但和外周血相比，冠脉血(CB, 从冠状静脉窦口取的血)的NETs含量有所下降。因此作者推测NETs可能congested in coronary vessels。
Fig 1c： 因此作者对左心耳切片做了染色，发现AF患者的左心耳和冠脉中有NETs形成。
Fig 1d： However unlike mainly concentrating in coronary vessels after MI, NETs in AF also scattered beyond the coronary vessel.
2. NETs lead to cardiomoyocyte apoptosis by promoting autophagy
在此前心梗的研究中，作者发现NETs可以激活Smad3和MAPK信号通路，从而引起成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，促进心肌病理性纤维化及室壁瘤形成。考虑到心肌细胞的丢失对心脏重塑至关重要且NETs包含多种细胞毒性蛋白酶，作者探究了NETs对心肌细胞的毒性作用。
Fig 1e： 作者将NETs与心肌细胞共孵育，使用Nanolive 3D-holomotomographic microscopy进行了观察。显示心肌细胞存在atrophy 和 perinuclear granule increase.
Nanolive实时无标记活细胞断层扫描3D显微镜
Fig 1f, g： 流式结果提示和NETs共孵育的心肌细胞死亡增加（DNase I是NETs抑制剂）
Fig 1h, i： western结果显示和NETs共孵育的心肌细胞cleaved caspase3/caspase 3也增加，提示NETs对心肌细胞具有毒性作用。
在与NETs共孵育时，心肌细胞中的perinuclear granules显著增加。在自噬过程中，增加的溶酶体可以relocate to the perinuclear region，因此作者随后探究了自噬是否参与了NETs-induced cell death。
Fig 2a： p62的免疫荧光显示和NETs共孵育后，心肌细胞自噬增加。
Fig 2b, d： p62 和 Beclin-1的蛋白水平也增加。
Fig 2d, e： 而使用3-methyladenine (3-
MA, 自噬阻断剂)部分阻断了NETs诱导的cleaved caspase3的增加。
Fig 2f, g： 3-MA对NETs诱导的心肌凋亡的保护作用在PI staining 和 Celigo中也得到了一致的结果。
3. NETs lead to mitochondrial damage by promoting mitochondrial depolarization and reactive oxygen species production
由于线粒体对于心肌功能非常重要，而线粒体失代偿和ROS过度产生可以引起细胞死亡。因此作者探究了NETs对心肌细胞线粒体的作用。
Fig 2h： 在和NETs共孵育后，心肌细胞中的肿胀线粒体显著增加
Fig 2i-l： 随后作者分别使用了JC-1和MitoSOX比较了线粒体膜电位和线粒体ROS产生。结果显示NETs引起线粒体膜电位去极化(i, j)，ROS产生也增加(k, l)。
- JC-1 形成带有红色荧光的聚集体（在健康的线粒体中）。随着膜电位的降低，JC-1 变成单体，呈绿色荧光。
红绿荧光比例的变化被用作线粒体状况的指标。
- MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator，一种新型线粒体荧光探针，可特异性靶向线粒体，从而选择性检测线粒体内的超氧化物。该探针可透过活细胞膜， 并选择性进入线粒体。一旦进入线粒体， 该探针即可被超氧化物氧化发出红色荧光。本品可被超氧化物而非其他活性氧类(ROS)和活性氮类(RNS)快速氧化。氧化产物结合核酸后，可产生大量荧光。
4. Ang II alone cannot directly initiate NETosis
炎症可以促进房颤的发展，反过来，房颤也可以促进炎症。然而AF诱导的炎症反应比MI要弱，MI中大量的促炎因子和oxidants可以诱导NETosis。出了炎症相关的刺激，other molecules are ubiquitously made of the capability to induce NETosis. Akt在NOX依赖的NETosis中至关重要，而且Akt的磷酸化在NETosis中上调。此前有研究显示AF中升高的Ang II可以诱导心室重构，而且Ang II type 1 (AT1) /受体信号通路可以引起Akt的磷酸化。
Fig 3a：和此前的报道一致，作者发现房颤患者外周血中Ang II升高。
Fig 3b, c：有文献报道0.1 nM Ang II可以以ROS/autophagy依赖的方式显著诱导NETosis。然而作者的实验结果显示Ang II诱导了apoptosis 而不是 NETosis。尽管Ang II干预后中性粒的cell-free DNA (cfDNA)增加，Celigo IF pictures 没有观测到typical NETs structure。
Fig 3d, e： 通过检测cleaved caspase 3，作者发现Ang II可以剂量依赖性的诱导中性粒细胞凋亡。
Fig 3f, h： Ang II也没有诱导中性粒细胞的自噬
5. Ang II promotes PMA-induce NETosis
但Ang II可以协同PMA间接促进NETs生成（而不是直接诱导NETs生成）。
6. Supernatants of tachy-paced neonatal rat cardiomyocytes could induce NETosis as increased mitochondrial DNA and high mobility group box 1 secretion
由于Ang II alone并不能诱导NETosis，因此AF中一定存在着可以引起NETosis的其他刺激。
有文献报道mtDNA可以诱导NETs形成，还有文献报道心肌细胞在tachy-pacing后出现线粒体功能障碍。因此作者假设tachy-paced cardiomyocytes可能释放mtDN来引起NETosis。
Fig 5a： 研究人员给予乳鼠原代心肌细胞快速起搏刺激构建房颤细胞模型 (tachy-pacing: 6 Hz, 40 V, 10 ms pulses; normal pacing: 1HZ, 40 V, 10 ms pulses)。结果显示tachy-pacing下1h心肌细胞即出现显著死亡。
Fig 5b, c： 刺激3小时后tachy-pacing组的cfDNA 和 mtDNA 水平都显著升高。
Fig 5d： 此外作者发现心肌的快速起搏导致HMGB1从细胞核到细胞质的转位。(HMGB1可介导NETs引起的细胞毒性作用)
Fig 5e, f： 随后，作者将中性粒细胞与PMA、正常起搏的心肌上清、快速起搏的心肌上清、快速起搏的心肌上清+AngII 共孵育，发现快速起搏的心肌上清可以诱导NETs产生，而且在快速起搏的心肌上清+AngII组中更显著。值得注意的是，正常起搏的心肌上清对NETs的诱导作用降低，提示正常心肌可能会分泌细胞因子保护中性粒免于NETosis。
7. DNase I intravenous injection downregulates NETs formation, ameliorates AF-related fibrosis and decreases the AF duration
最后，研究人员在体内验证了NETs抑制剂DNase I对房颤是否具有保护作用。结果显示，DNase I抑制了房颤大鼠左心房的胶原沉积增加及p-Smad2、p-p38水平的升高，还抑制了房颤大鼠心房组织自噬水平的上调，并有效降低了大鼠房颤的发生率和持续时间。
综上所述，本研究发现，房颤患者外周血NETs水平显著升高，而NETs诱导了心肌细胞自噬性凋亡，并通过促进线粒体去极化和ROS的产生导致线粒体损伤。持续的过速起搏导致心肌细胞损伤，为诱导中性粒细胞分泌NETs提供了有利的刺激。同时，房颤中升高的Ang II与心肌细胞损伤产生的刺激协同增加了NETs的生成及NET诱导的细胞毒性作用。该研究揭示了房颤中NETs的形成机制，阐明了由NETs和心肌细胞分泌的刺激组成的正反馈促进心脏纤维化及房颤进展的机制。
