引言

在药物靶点筛选过程中，许多研究者都被一系列实操难题困住：

化合物修饰是否会影响我的药物活性？

什么化合物适合做修饰，什么化合物特征不适合做修饰？

我们该如何判断手中的化合物能否用于修饰筛选？

确定修饰可行性后，又该从众多靶点筛选技术中选择适配方案？

带着这些问题，小谱今天就带大家一起探讨：哪些化合物是“修饰友好型”、哪些是“碰不得的禁区”，教你3步快速判断自己的化合物能不能修饰，以及如何匹配最合适的筛选技术。

01 分子层面的博弈：化学修饰对生物活性的深层影响

一个小分子药物与蛋白质的结合依赖氢键、范德华力、疏水作用等形成的精妙平衡，化学修饰引入的额外原子或基团，极易打破这种平衡，干扰分子生物学行为。

（一）空间位阻与结合口袋的排斥

蛋白质的活性位点或变构位点多为深埋的疏水空腔，若在小分子关键药效团附近添加修饰基团（如Linker、生物素），会产生明显空间位阻，阻碍分子进入结合口袋，导致亲和力呈指数级下降。例如，PROTAC分子设计中，仅3个碳原子的连接链长度变化，就可能彻底改变其靶点选择性。

（二）物理化学性质的剧变

除了直接的空间冲突，修饰还会显著改变分子的ADME（吸收、分布、代谢、排泄）性质：

①　溶解度：疏水性探针会降低化合物水溶性，导致其在培养基中聚集，产生假阳性吸附；

②　膜通透性：引入极性或带电荷基团（如生物素），会阻碍分子穿透细胞膜，无法开展活细胞原位筛选；

③　分配系数（LogP/LogD）：修饰可能改变分子脂水分配比例，使其无法到达线粒体、细胞核等特定细胞器内的靶点。

02 核心判据：如何识别“可修饰”的化合物

判断一个化合物是否适合修饰，核心在于寻找“出口矢量” ——分子中指向溶剂暴露区域、且不参与关键蛋白-配体相互作用的原子或官能团，仅在此类位点延伸，才能最大程度保留原分子的生物活性。

（一）基于共晶结构的出口矢量识别

当靶点已知且存在高分辨率的共晶结构（X-ray或Cryo-EM）时，识别出口矢量相对直观。

①　溶剂可及性分析

通过计算配体在结合状态下的溶剂可及表面积，可精确定位暴露在溶剂中的原子。通常，位于结合口袋外缘、指向溶剂侧的基团是理想的修饰位点。例如，在CDK4/6抑制剂Ribociclib的探针设计中，研究者利用晶体结构信息，确定其哌嗪环上的氮原子朝向溶剂区，在此处引入Linker未显著影响其抑制活性。

②　电子密度图与空腔分析

利用PyMOL或Chimera等软件分析电子密度图，可识别结合口袋周围的空余空间。若某一方向存在较大的空腔或通道，该方向的取代基往往能容纳较长的连接链而不产生位阻。

（二）基于SAR数据的经验推断

在缺乏晶体结构的“盲筛”阶段，构效关系（SAR）数据是判断修饰可行性的唯一灯塔。

①　同系物扫描

若一系列结构类似的化合物（如甲基、乙基、丙基取代物）表现出相近的生物活性，说明该取代位点对空间体积变化具有一定耐受性，通常是潜在的出口矢量；反之，若某一位点的甲基化导致活性丧失，则该位点属于“禁区”。

②　模块化合成策略

对于通过组合化学合成的分子，其连接不同模块的接头（Linker）部分往往是天然的出口矢量。例如，许多PROTAC分子本身由靶蛋白配体、E3连接酶配体和Linker组成，其Linker附着点已经过验证。

（三）生物物理辅助判定：STD-NMR与GEM

饱和转移差示核磁共振（STD-NMR）和基团表位映射（GEM）技术可在溶液状态下测定小分子的哪些质子与蛋白质紧密接触。

▶STD-NMR原理：只有与蛋白质紧密结合的配体质子才会接收到来自蛋白质的磁化转移，信号弱或无信号的质子通常位于远离结合界面的溶剂暴露区，提示其为可修饰位点。该方法特别适用于亲和力较弱的片段化合物筛选。

（四）适合修饰的化合物特征画像

综合文献数据，以下特征提示化合物具有较高的修饰潜力：

03 警惕陷阱：不适合修饰的化合物特征

（一）泛抗体干扰化合

PAINS是药物筛选中最大的假阳性来源。

▶特征：包含烯酮、姜黄素类、儿茶酚、醌类等结构单元。

▶机制：通过非特异性的氧化还原反应、膜扰动、金属螯合或荧光猝灭干扰检测信号，而非特异性结合靶点。

▶修饰后果：修饰会进一步放大其非特异性吸附能力，导致Pull-down实验中出现大量“粘性”蛋白，掩盖真实靶点。

（二）极简结构与高配体效率分子

对于分子量极小（<250Da）且配体效率极高的分子（如阿司匹林、二甲双胍或某些片段分子），其每一个原子都对结合能有显著贡献。

▶判断逻辑：若分子的所有边缘都参与了相互作用，无“溶剂暴露面”，任何修饰都会破坏核心药效团，强行修饰无异于破坏分子骨架。

（三）复杂天然产物

尽管许多天然产物是大分子，看似有修饰空间，但其实际操作难度极高：

▶全合成瓶颈：许多天然产物缺乏全合成路线，仅能通过半合成修饰；若分子缺乏反应活性位点，或唯一反应位点是活性关键位点，则修饰不可行。

▶立体化学敏感性：复杂天然产物的活性依赖特定立体构象，化学反应条件可能导致构型翻转或骨架重排，使分子失活。

（四）代谢不稳定性分子

如果化合物在细胞内极易被代谢（如酯类前药被酯酶水解），修饰后的探针可能具有完全不同的代谢动力学特征。

▶ 案例：某些探针进入细胞后，其Linker极易被细胞内的非特异性酯酶或蛋白酶切断，导致“弹头”与“标签”分离，质谱检测到的只是标签结合的蛋白，而非药物靶点。

04 技术平台决策指南：从有标记到无标记的演进

当明确了化合物的修饰潜力后，研究者面临的是具体的筛选技术选择。目前的主流技术可以划分为两大阵营：基于亲和富集的标记技术和基于生物物理特征的无标记技术。

阵营一：基于修饰的标记技术

这类技术的核心逻辑是“钓鱼”：利用修饰后的探针从复杂的蛋白混合物中特异性地拉出靶蛋白。

①　小分子亲和层析（Affinity Chromatography / Pull-down）

这是最经典、最直观的方法。

▶原理：将小分子通过Linker偶联到固相基质上，细胞裂解液流过基质时，靶蛋白被捕获，非特异性蛋白被洗去。

▶关键Protocol细节：必须设置游离小分子竞争组，若某蛋白条带在竞争组中消失，证明其结合是特异性的。

▶适用性：适用于结合力强、解离慢的化合物。

②　光亲和标记（Photoaffinity Labeling, PAL）

针对弱相互作用或瞬时结合的靶点，PAL是更优选择。

▶原理：探针包含配体、光反应基团和报告基团，紫外光激发下，光反应基团产生高活性中间体，瞬间与邻近氨基酸形成共价键，锁定“瞬时”相互作用。

▶优势：能够捕获低亲和力靶点；可在活细胞内进行原位标记，更真实反映生理环境。

▶挑战：光反应基团本身较大，易引入位阻；非特异性标记背景较高。

③　蛋白芯片（Protein Microarrays）

▶原理：将数千种纯化蛋白固定在玻片上，用荧光标记的小分子孵育。

▶局限：芯片上的蛋白往往是非天然构象，且无法覆盖全蛋白质组，在现代药物筛选中已逐渐让位于质谱技术。

阵营二：现代无标记技术（Label-Free Technologies）

随着高分辨质谱（HRMS）的普及，无标记技术因其无需修饰化合物、能够覆盖全蛋白质组的优势，正成为药物研发的新宠。其核心逻辑是检测配体结合引起的蛋白质生物物理性质（热稳定性、蛋白酶抗性、溶解度）的变化。

①　细胞热位移分析与热蛋白质组分析（CETSA / TPP）

这是目前应用最广泛的无标记技术。

▶原理：基于配体结合导致蛋白质热稳定性增加，加热变性过程中，结合药物的靶蛋白比未结合的蛋白更晚发生沉淀（Tm值升高）。

▶核心优势：

原位性：可在活细胞甚至组织切片中进行，反映药物在拥挤细胞环境中的真实结合。

覆盖度：单次实验可监测6,000-8,000种蛋白。

▶局限性：

热不敏感蛋白：约20%-30%的蛋白缺乏明显的熔解转变，无法被TPP检测。

假阴性：某些药物结合并不引起显著的热稳定性变化。

②　限制性蛋白水解-质谱（LiP-MS）

▶原理：基于配体结合改变蛋白质的构象，从而阻挡非特异性蛋白酶的切割位点，药物结合区域的肽段会受到保护，免于被酶解。

▶分辨率优势：不仅能鉴定靶蛋白，还能精确到结合的肽段，提供类似于共晶结构的分辨率信息。

▶技术演进：最新的LiP-Quant和STEPP-LiP技术结合了机器学习算法，能区分药物结合引起的构象变化与变构效应，显著降低假阳性。

③　其他无标记技术（DARTS, SPROX, SIP）

▶DARTS：LiP-MS的低通量版本，使用凝胶电泳检测蛋白酶抗性，操作简单，适合实验室快速验证。

▶SPROX：利用化学变性剂梯度和甲硫氨酸氧化速率测定稳定性，对高分子量蛋白复合物和非典型激酶具有独特检测优势。

▶SIP/DiffPOP：利用有机溶剂诱导蛋白沉淀，检测药物结合导致的溶解度变化，成本低，但覆盖度不如TPP。

深度对比：如何选择你的武器？

为了帮助大家在复杂的实验方案中做出选择，小谱将这些技术整理为以下决策矩阵：

结语

药物靶点筛选是一场在微观世界中进行的侦探游戏。化合物的化学修饰是解开谜题的钥匙，但也可能是干扰视线的迷雾。作为研究者，我们需要：

①　敬畏结构：充分理解每一次原子改动背后的热力学代价。

②　拥抱新技术：在条件允许时，优先考虑TPP、LiP-MS等无标记技术，以获取最接近生理状态的真实数据。

③　坚持验证：永远不要相信单一实验的结果，正交验证是科学结论的基石。

希望这篇指南能为你在迷雾重重的靶点筛选之路上，点亮一盏明灯。

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LiP - MS科研buff 加持！药物靶点研究3大场景轻松破局

▶ 药物靶点筛选：在体外生理条件下，寻找小分子药物可能的作用靶点。

▶ 药物 - 蛋白结合域分析：于体外生理条件中，探究纯化重组蛋白和目标药物的作用区域以及结合位点。

▶ 药物机制研究：在体内给药的条件下，钻研小分子药物潜在的作用靶点及其发挥作用的机制。

参考文献

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