研究背景
细胞基因过表达（cell gene overexpression）通常是指将目的基因CDS（coding sequence）克隆到相应的质粒或病毒载体上，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因表达量增加的目的。当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。此外基因过表达还广泛用于药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病临床诊断和基因治疗等研究。
基因过表达按照表达时间的长短可分为瞬时表达和稳定表达。瞬时表达一般是将目的基因CDS真核表达质粒通过物理（如电转）或化学方法（如磷酸钙转染、脂质体转染）直接递送到细胞内，质粒会短暂地存在于转染细胞然后目的基因实现转录和翻译，在短时间内达到基因过表达效果。但随着时间增加，细胞内的质粒逐渐降解，目的基因的高表达又会降低或者消失。瞬时表达细胞的基因表达水平是不稳定的，所以有时候实验重复性较差并且不能进行周期较长的实验。
基因稳定过表达细胞一般是指目的基因CDS序列插入到细胞本身基因组DNA中，成为细胞自身遗传物质一部分。目的基因序列会随着细胞增殖稳定遗传，在长时间内实现基因稳定过表达。如果是单克隆细胞系的话，该目的基因的表达在长时间内表达量都基本是稳定不变的，十分适合进行长期实验。所以基因稳定过表达细胞株构建也成为一项基本实验需求。
研究方法
那如何获得基因稳定过表达细胞呢？大家的第一想法肯定是用慢病毒。慢病毒载体（Lentiviral vector, LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有很高的感染效率。它能高效的将目的基因导入各种细胞系。慢病毒载体基因组进入细胞后，目的基因的DNA随机整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白。利用载体中所含的抗性标志或者荧光标记进行筛选，可得到稳定表达特定基因的细胞株。
虽然慢病毒构建稳转细胞株的方法十分普遍。但是目前很多实验室并不具备进行慢病毒包装的设备条件（BL-2级生物安全柜）或者相关包装生产技术。如果从质粒构建，病毒包装，细胞感染等实验从头学习，要付出较多时间和精力。此外，慢病毒载体LTR之间序列大小不能超过8K(实际上超过6K的，病毒滴度都会明显降低)，基因序列过长会严重降低病毒滴度甚至无法进行慢病毒包装。所以，小编先教大家一种新的基因过表达方法。
转座子（Transposon）介导稳定细胞株构建
转座子（Transposon）也称“跳跃基因”，是普遍存在于各种生命细胞内的可移动的遗传信息元件，通过“剪切和粘帖”机制实现DNA片段在染色体内部/之间高效转移。
工程化的转座子系统由两部分组成，一部分包括位于转座子基因两侧的顺式元件短末端反向重复序列（ITR）和位于两个ITR序列之间的基因编码序列；一部分包括转座酶编码序列。将转座子的这两部分分别构建在两个独立载体上，将两个载体共转染目的细胞，转座酶通过识别转座载体中的ITRs序列，将ITRs之间的序列切割下来，然后插入到染色体基因组的TTAA位点，就能实现目的基因在细胞基因组上整合，达到基因稳定表达目的。
转座子稳转细胞系构建流程
（1）构建载有目的基因的重组转座子载体；
（2）复苏目的细胞，细胞状态良好，接种于6孔板中，待细胞汇合度大于80%，进行细胞转染；
（3）共转染时，将重组转座子载体和编码转座酶载体，转染试剂，按比例均匀的混合后加入到细胞孔中，前后轻轻摇晃混匀，37℃，二氧化碳培养箱培养。
（4）转染48小时后，加入对应的抗性筛选培养基，同时设置未转染的阴性对照，连续筛选培养一周，阴性对照组细胞全部凋亡，并转染细胞呈逆抗性生长。连续扩增培养，qPCR检测目的基因的表达水平，并传代培养检监测目的基因的表达稳定性。
（5）分离单克隆细胞（可选）。
转座子VS慢病毒
最后，小编给大家总结了使用转座子系统和慢病毒方法构建基因过表达稳定细胞株的优缺点：
非常值得一提的是在基因治疗及临床应用方面，与慢病毒不同，转座子系统是virus-free系统，不需要增加安全级别。例如在针对肿瘤的CAR-T治疗领域，转座子系统简单，快捷的转导可能会规避这一风险，同时更有效，特别是随着CAR-T修饰升级换代，外源基因序列的增大，转座子系统的优势会更加明显。
舒桐生物科技长期致力于Transposon系统的开发和优化，对转座酶经基因工程优化获得了活性更高的超级转座酶，进一步提升了目的DNA整合到宿主基因组中的效率，非常适合大片段DNA和长基因的转基因应用。我们可提供目的基因查询+质粒构建+细胞转染+稳定细胞系筛选+单克隆筛选等一条龙服务，大家赶紧试试新方法吧！
