今天分享一篇关于番茄愈伤组织的空转文章，是由北京大学现代农业研究院在PNAS上发表了题为“Spatial transcriptomics reveals light-induced chlorenchyma cells involved in promoting shoot regeneration in tomato callus”的研究论文，这个paper建立了首个植物愈伤组织芽再生的空间转录组图谱。在这个文章中，作者利用了深圳华大BGI Stereo-seq、青岛百迈客BMKMANU S1000以及美国10X Visium三种空间转录组技术，以及10X Chromium单细胞核转录组技术，首次揭示了番茄愈伤组织内部细胞的异质性，并在单细胞水平上详细解析了激素信号和重要调控因子在各种组织和细胞中的表达情况。
植物在遭受损伤后能够重新编程体细胞，实现新组织或器官的再生。愈伤组织是由植物体细胞诱导产生的一类拥有再生潜能的细胞，广泛应用于现代农业领域，包括植物营养繁殖和基因编辑等分子育种技术。其中，愈伤组织细胞经过芽再生过程最终发育成可育芽，这一过程对于植物再生至关重要。作者这篇文章中利用番茄作为实验材料，因为番茄是一种全球重要的经济作物，但在其愈伤组织中芽再生的分子机制仍有很多未知。
========实验设计============
实验材料：当子叶切完，第16天能发现明显的再生芽的时候（1A）。
取了4份材料，分别采用了深圳华大BGI Stereo-seq、青岛百迈客BMKMANU S1000以及美国10X Visium三种空间转录组技术，以及10X Chromium单细胞核转录组技术（1B）。
==========结果==========
1. 番茄愈伤组织空间转录组图谱
通过华大的Stereo-seq技术，获得了28,036个cell，共19,821个基因（每个cell平均451个基因）。聚类之后，获得了7个cluster。注释之后，将番茄愈伤组织分为了表皮、维管组织、芽原基、成熟芽和内部愈伤组织五种细胞类型。其它2个技术，例如BMKMANU S1000获得了3511个spots（50 um），每个spots上平均有1287个基因表达。10X Visium技术获得了2051个spots (100 um)，平均每个spot上有2797个基因表达。但是鉴定的细胞类型和华大的Stereo-seq结果类似。
通过核转录组，获得了17214个cell，每个cell平均有1736个基因表达。聚类分成了22个cluster，注释结果也和华大空间转录组的结果类似。
2. 表皮细胞的异质性和功能多样性
作者单独把表皮细胞拿出来，进行了再次聚类。然后发现表皮细胞可以再分成2类，分别是1和2. 这两类表皮细胞1一般位于air和medium的位置（不确定如何翻译）（2A,2B,2C），大概指的是一类是外面和空气接触那层，2类则大多数是与下面组织或者培养基挨着那层。然后对这个子类的marker基因做了GO的富集分析（2D），发现1类表皮细胞的功能大多是与cuticle development, lipid transport和respose to water的，说明1类表皮细胞是与地上部的表皮细胞功能类似，与保护和保水功能相关。2类表皮细胞功能大多数是与多糖，糖酵解，跨膜转运功能相关，说明2类表皮细胞更多是与能量转运，营养元素吸收相关的。图2E作者highlight了几个关键GO相关基因在空间位置的表达情况。
3. 维管束对于牙再生的支撑作用
上面讲了2类表皮细胞的营养吸收转运功能，通常情况下维管束细胞也是具有这些功能的。所以作者又开始highlight维管束细胞。然后发现两类：一种具有类似根或茎的中央木质部，另一种具有沿着侧面延伸的类似叶脉的木质部（3A）。维管束细胞特异表达基因的GO富集分析也表明主要在：vascular development-related processes(xylem and phloem pattern formation和plant-type secondary cell wall biogenesis)。另外一些能量转运相关的，例如：polysaccharide metabolism, response to sucrose, and transportation processes like amino acid transport, auxin transport, and metal ion transport等（3B）。说明维管束和营养以及能量代谢转运相关。这也与2类表皮细胞的功能类似，从而说明2类表皮细胞和维管束细胞一起代谢和转运芽再生相关的能量物质元素。类似的，作者在3C里面highlight了一些GO相关的关键基因的空间表达特征。
4. 芽原基在空间的细胞异质性
芽原基细胞作为芽的初始细胞，可以发育成未来的SAM和整个芽，是再生过程中至关重要的细胞类型（4A）。通过空间转录组数据，作者发现芽原基细胞主要位于1类表皮细胞附近（4B和4 C）。一些常见再生相关的基因，例如：SlPLT3, SlWUS, SlSTM, and SlCUC1，经过查看也是在芽原基细胞中特异表达，从而确认了数据的准确性。作者还发现，auxin signaling, cytokinin signaling, abscisic acid (ABA) signaling, and shoot primordia相关的基因呈现高度的相关性，也从一定层面说明了ABA，auxin和cotokinin在再生过程中起着关键的作用。接着鉴定要一个基因：SlPI51，在叶原基细胞总特异表达（4D）。原位杂交结果也说明了同样的结果（4E）。
紧接着，作者又把芽原基细胞分成了3类：1,2和3（4F和4G）。RNA速率发现呈现一个从1和3类的分化进程（4H和4I）。两个和细胞分裂的著名基因：SlWUS 和SlMYB3R4，也发现在1类芽原基细胞中特异表达（4J）。然后作者鉴定了每类芽原基细胞特异表达的基因（4K），并做了GO富集分析。分析结果表明1类细胞主要是和细胞分裂，细胞周期等相关。而2类主要是和auxin transport, stem cell population maintenance和organ growth等。3类主要是和differentiation, such as photosynthesis, carbon fixation和primary root development等相关，这雨观察到的结果也是相符的（4L）。
5. 光诱导了芽原基周围的绿色组织细胞从而促进了芽的再生
空间转录组技术优势在于揭示不同细胞间位置关系。作者发现番茄愈伤组织的芽原基被表达光合基因的细胞包围，这些细胞含叶绿体，称为绿色组织（chlorenchyma）细胞（5A和5B）。这些尤其的分布，让作者有了有趣的假设。因为绿色组织细胞一般是光诱导的，所以作者很感兴趣是否光也能影响芽的再生。然后作者发现，从light转移到dark之后抑制了绿色组织细胞和芽的再生，但是从dark转移到light之后则是有促进作用（5C和5D）。并且持续黑暗然后再转移到light之后和在持续light下面的再生速率差不多。这说明光照可能不是影响愈伤组织的分化，而是影响了芽原基的分化（5D）。
为了更深入的探索光照的影响，作者对dark，light，dark to light，light to dark的样品进行了转录组测序，结果发现和dark相比，dark to light显著的诱导了叶绿体发育相关的基因，例如：SlCAB, SlLHCA, 和SlLHCB。同时，也诱导了氮元素吸收转运相关的基因，以及cell cycle相关的基因，例如：SlCYCB 和SlCYCD等（5E）。同时芽原基相关的基因，例如：SlPLT3, SlPLT7, SlCUC1和SlSTM，也被显著诱导了（5F）。
光合抑制剂DCMU减慢芽再生速率，证明绿色细胞光合必要性（5G和5H）。
下面作者就要回答为什么绿色组织中的光合作用可以影响芽原基的分化。以前的研究表明，光合作用的产物，蔗糖可以通过TOR途径影响芽和根的分生组织。作者发现，与周围的绿色细胞相比，负责将蔗糖转化为葡萄糖的蔗糖转化酶基因和SlTOR基因在芽原基中的空间表达相对较高，这表明绿色细胞产生的蔗糖可以转移到芽原基并转化为葡萄糖，以激活葡萄糖TOR信号通路，从而促进芽原基的分化（5I）。所以当添加一直TOR活性的Torin2后，抑制了芽再生的形成（5J和5K）。
综上所述，该研究用多种技术构建了番茄愈伤组织芽再生阶段的空间转录组图谱。揭示了细胞多样性，鉴定了芽原基形成关键因子。结果强调了光合和TOR信号在芽再生中的关键作用。这些发现提升了我们对番茄愈伤组织芽再生的理解，并证明了空间转录组学在植物生物学研究中的巨大潜力（图5L）。
