由于环境条件没有控制好和操作不当等原因，细胞培养中常可发生细菌和霉菌的污染。
常见污染的细菌有：革兰氏阴性菌，如大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等；革兰氏阳性菌有葡萄球菌等。真菌污染在炎热潮湿的季节常可发生，如烟曲霉菌、黑曲霉、毛霉菌、孢子苗等。霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长或杀死细胞，镜下可见胞浆内出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃从壁上脱落。对于污染的观察，霉菌污染易于发现，肉眼可见白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，有的散在生长，镜下可见丝状菌丝，纵横交错于细胞之间。而细菌污染较重时可见培养基上清浑浊，较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行培养及培养加以确定。
目前细胞培养过程中最主要的问题就是污染，污染可导致细胞的死亡，使其作为科研的原料不可再用，造成人力、财力和实践的损失，因此一定要尽量避免污染的发生。一般可从以下三个途径来控制污染的发生：
一. 细胞培养的室内环境
细胞培养室内应相对封闭，洁净无尘，设有缓冲间。细胞培养间配备枪式移液器、手术器械、离心机、冰箱等专用仪器设备以及专用的实验服和拖鞋，定期消毒。专用物品只在培养间内使用，不得带出培养间。培养间和缓冲间每周彻底清洁消毒一次。
二. 细胞培养的试剂和用品
工作中要特别注意防止培养液和血清的污染。培养细胞所用的血清必须储存于-20至-70℃，但也不能超过一个月，解冻时在4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，在溶解过程中要规则摇晃均匀，使温度与成分均一，这样可以减少沉淀。最好不要直接在37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
三. 无菌操作和对实验人员的要求
有很多污染的发生都与操作不当有关，而细胞培养试验的操作应是严格的无菌操作。首先试验进行前，无菌操作台面、废液缸及实验用品均应用紫外灯照射30-60分钟灭菌；以75%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后方可开始实验操作。在无菌操作台进行实验前须戴一次性乳胶手套，并用75%酒精擦拭。
实验用品及试剂瓶应以75%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在台面的中央无菌区域；不能在打开的容器的正上方操作实验；移液时吸量管口不要触碰细胞培养皿；试剂瓶及培养瓶关盖时要先在酒精灯上转圈灼烧瓶口片刻，以防止试剂的污染。在培养超过一种的细胞时，还要防止不同细胞间的交叉污染。
对实验人员的要求：实验人员进培养间之前，须先洗手，在缓冲间换穿专用实验服和拖鞋，准备好与细胞培养操作实验有关的所有试剂和用品，严禁在实验进行时频繁出入培养间。要求实验人员规范操作，严格遵守无菌工作流程。做完实验后应将实验产生的废物和废液及时移出培养间，并清洁无菌工作台面。
细胞培养中最常见最难发现的一种污染是支原体污染，针对支源体污染，海星生物推出的支必清支原体清除试剂盒，经验证，可有效去除莱氏无胆甾原体（Acholeplasmalaidlawii）、精氨酸支原体（Mycoplasmaarginini）、猪鼻支原体（Mycoplasmahyorhinis）和口腔支原体（Mycoplasmaorale）等支原体。在动物细胞培养中，这些支原体菌株占污染的85%以上。支原体污染验证的细胞株常会出现大量黑色颗粒，称为黑胶虫。
