文章导读
发表单位：南京农业大学、苏州大学
发表期刊：Plant Biotechnology Journal
影响因子：10.1
发表时间：2025年2月19日
DOI:10.1111/pbi.14573
基因型限制对绝大多数植物物种的稳定转化构成了重大瓶颈，从而严重阻碍了植物生物工程的发展，尤其是作物。纳米颗粒（NPs）可以作为核酸瞬时递送的有效载体，以不依赖基因型的方式促进植物中的基因过表达或沉默。然而，NP 介导的瞬时系统在植物综合基因组研究中的应用仍未得到充分探索，尤其是在面临遗传转化挑战的作物中。因此，迫切需要高效的 NP 介导的递送系统，该系统能够产生具有均匀转化核酸的整株植物或幼苗。
最近，南京农业大学张文利教授团队联合苏州大学康振辉团队与黄健团队，在PlantBiotechnology Journal期刊上发表了题为”Modified carbon dot-mediated transient transformation for genomic and epigenomic studies in wheat”的论文。团队开发了一种简单高效的修饰碳点（MCD）介导的瞬时转化系统，用于将 DNA 质粒递送到小麦种子中，该系统也适用于其他植物物种。该系统有助于生成包含转移的 DNA 质粒的整株幼苗。研究表明，该系统是小麦进行功能基因组研究的绝佳平台，包括基因功能的验证、蛋白质相互作用和调控、组学研究和基因组编辑。MCD 兼具环境友好性和跨物种适用性，为作物功能基因组研究和遗传改良提供了创新工具，有望推动植物生物技术领域的跨越式发展。
研究内容
团队对改良碳点（MCD）介导的小麦及其他植物物种的瞬时转化进行了研究，将新合成的改良碳点（MCD）与含潮霉素抗性基因及 LUC/GFP/GUS 报告基因的 DNA 质粒混合，处理多种小麦品种种子。结果显示（图1），转化后的小麦幼苗在两叶期无显著表型变化，表明 MCD 处理不影响种子萌发和幼苗生长。全株检测到清晰的 LUC/GFP 信号，且信号强度在第 4–8 天保持较强水平，第 10 天显著减弱，提示质粒 DNA 随时间降解。此外，MCD 介导的转化系统在玉米、大豆、黄瓜等 8 种难转化植物中均有效，证实其跨物种适用性。分子水平验证显示，目标基因（SAMMT、NLR1）的转录和蛋白表达水平显著升高，确认 MCD 可高效递送 DNA 并实现瞬时表达。
之后，团队使用该系统进行了蛋白质与蛋白质或顺式调控元件互作的验证，结果显示（图2），通过双分子荧光互补（BiFC）和分裂荧光素酶（Split-LUC）实验，证实小麦 TaHAG1 与 TaBZR1、棉花 Rf2b 与 PRE6 的物理互作，荧光信号定位于细胞核。免疫共沉淀（Co-IP）进一步验证 TaSG1 与 TaSIP2/3/4 的体内互作。在顺式调控元件分析中，Rf2b 与 PRE6 启动子共转化后 LUC 信号显著增强，证实转录因子对靶基因的激活作用。此外，白粉菌诱导型增强子在病原菌接种后，GFP 信号和基因表达水平显著上调，表明该系统可有效验证诱导型调控元件活性。
团队还利用该系统对候选基因在生物或非生物抗性中功能进行验证（图3），过表达抗病基因 NLR1 和已知抗病基因 Pm21 的小麦幼苗，对白粉病（E26）表现出显著抗性，病原菌孢子形成受抑制；过表达bHLH基因的植株对镰刀菌抗性增强，茎部褐变减轻。在抗逆性验证中，HSF1 过表达株在40℃高温胁迫下正常生长，而HSF2过表达株出现萎蔫，揭示两者在耐热性中的拮抗作用。发芽率实验显示，基因过表达不影响种子萌发，排除转化处理对生长的干扰。
团队还利用该系统进行了免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀分析（图4），免疫共沉淀（Co-IP）实验通过抗 HIS/FLAG 抗体，成功共沉淀 TaSG1 与 TaSIP2/3/4 蛋白复合物，证实其体内物理互作。染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）显示，过表达组蛋白突变体 H3K4M 导致全基因组 H3K4me3 修饰水平显著下降，修饰峰在基因间区分布比例增加（25% vs. 24%），外显子分布减少（44% vs. 46%）。共鉴定出 17,773（H3K4M-OE）和 35,483（CK）个 H3K4me3 峰，其中 8,671 个峰共享，揭示表观遗传调控的全局变化。
最后，团队还利用MCD联合基因枪递送 CRISPR-Cas9 质粒至小麦种子，靶向 NLR1/NLR2 基因的突变率最高达 11.66%（碱基插入 / 缺失），而单独使用 MCD 时突变率较低（2.87%–7.02%）。基因枪处理显著提升大片段缺失突变频率，但整体编辑效率仍较低，且突变多为瞬时性，未检测到可遗传编辑。结果表明，MCD 系统在基因组编辑中具有潜力，但需进一步优化递送策略以提高效率和稳定性（图5）。
研究总结
本研究开发了改良碳点（MCD）介导的瞬时转化系统，通过种子处理将 DNA 质粒高效递送入小麦等多种植物细胞，实现全幼苗基因瞬时表达。结合双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）等技术，表明该系统可快速验证抗病（如NLR1、Pm21）和抗逆（如 HSF1）基因功能，解析蛋白互作（如 TaHAG1-TaBZR1）及顺式调控元件活性，并通过 ChIP-seq 分析表观遗传修饰（如 H3K4me3）变化。结合 CRISPR-Cas9 系统，利用 Hi-TOM 技术检测到基因组编辑突变率提升（最高 11.66%），但仍以瞬时转化为主。研究表明，MCD 系统突破了传统转化的基因型限制，为植物功能基因组、表观基因组研究及作物抗逆改良提供了高效、环境友好的新工具，尽管基因组编辑效率仍需优化，但其跨物种适用性和操作简便性有望显著推动植物生物技术的发展。
