前两次教程“GEO数据挖掘（一）简单快速下载GEO数据”、“GEO数据挖掘（一）下载SRA库原始测序数据”已经分享过如何下载数据，本次将分享如何将geo数据内的差异基因提取出来，进行差异化分析，找到上调下调基因，再进行可视化展示。首先，我们得知道为什么需要对基因进行差异表达分析。因为在研究肿瘤等疾病的发病过程中，一些原本沉默的基因可能高表达，而一些原本正常表达的基因，其表达量可能就会下降，而恰恰就是这些相较于正常样本基因表达量发生变化的基因，它们控制或者影响着肿瘤的发生。因此，如果要研究肿瘤发生的机制，需要设立case（实验组）和control（对照组）进行差异差分析，探究表征实验组和对照组的差异表达基因，构建基因富集通路研究肿瘤发病机制，然后重点解读这些富集通路，并探究这些通路与样本的表型之间有着怎样的关系或者内在机制。

那么接下来将分四步为大家带来基因差异分析及可视化的全套代码分享：

第一步：提取表达矩阵、临床信息、芯片编号

使用列表取子集的方法提取eSet列表（我们下载好的原始数据）里的第一个元素：eSet[[1]]；并使用exprs函数把它转化成矩阵；通常使用：head（100），判断数据是否需要转换为log型。

#(1)提取表达矩阵exp----

exp <- exprs(eSet[[1]])

exp[1:4,1:4]

#exp = log2(exp+1) #判断是否需要log2

#(2)提取临床信息----

使用pData()函数可以得到每个样本的临床信息，通常数据框的来源列（source）或者特征列（characterizes）会描述哪些样本是control或者treatment。

pd <- pData(eSet[[1]])

#(3)提取芯片平台编号----

数据通常使用的是不同的芯片探针，后续根据GPL平台编号转化成entrez ID或symbol ID；

gpl <- eSet[[1]]@annotation

p = identical(rownames(pd),colnames(exp));p

save(gse,exp,pd,gpl,file = "step1_output.Rdata")#储存结果

第二步 构建分组、芯片注释

1.构建分组信息

根据所GSE内的样本来源信息进行分组。

rm(list = ls())

load("step1_output.Rdata")

library(stringr)

table(colnames(exp))

group_list = ifelse(str_detect(pd$source_name_ch1," tumor"),"test","normal")

group_list=factor(group_list,

                  levels = c("test","normal"))

group_list

table(group_list)

2.芯片注释

if(T){

  a = getGEO(gpl,destdir = ".")

  b = a@dataTable@table

  colnames(b)

  ids2 = b[,c("ID","GENE_SYMBOL")]

  colnames(ids2) = c("probe_id","symbol")

  ids2 = ids2[ids2$symbol!="" & !str_detect(ids2$symbol,"///"),]

}

save(group_list,ids2,exp,pd,file = "step2_output.Rdata")

第三步 数据检查---PCA

然后利用FactoMineR，factoextra包进行主成分分析，查看处理和对照是否有明显分组。

绘制主成分分析图

rm(list = ls())#清空环境

load("step1_output.Rdata")

load("step2_output.Rdata")

dat=as.data.frame(t(exp))

library(FactoMineR)

library(factoextra)

# pca的统一操作

dat.pca <- PCA(dat, graph = FALSE)

pca_plot <- fviz_pca_ind(dat.pca,

                        geom.ind = "point", # show points only (nbut not "text")

                        col.ind = group_list, # color by groups

                        palette = c("#00AFBB", "#E7B800"),

                        addEllipses = TRUE, # Concentration ellipses

                        legend.title = "Groups"

)

print(pca_plot)

ggsave(plot = pca_plot,filename = paste0(gse,"PCA.png"))

save(pca_plot,file = "pca_plot.Rdata")

第四步 差异化分析及可视化展示—火山图、热图

导入前两步的Rdata，使用limma包进行差异分析。简单来说，对基因差异分析就是对每个基因都进行差异检验，检验基因的logFC值、平均表达量、P.value是否显著等。差异分析的输入文件：1.表达矩阵；2.分组信息。Limma包做差异分析分为三个步骤：lmFit,、eBayes,、topTable。使用这个包需要三个数据：1.表达矩阵；2.差异比较矩阵；3.差异分析矩阵，分析结果需要重点看logFC值和P值。

rm(list = ls())

load("step1_output.Rdata")

load("step2_output.Rdata")

1.差异分析

library(limma)

design=model.matrix(~group_list)

fit=lmFit(exp,design)

fit=eBayes(fit)

deg=topTable(fit,coef=2,number = Inf)

head(deg)

2.为deg数据框添加几列

#1.加probe_id列，把行名变成一列

library(dplyr)

deg <- mutate(deg,probe_id=rownames(deg))

#tibble::rownames_to_column()

head(deg)

#merge将两个表整合起来

table(deg$probe_id %in% ids$probe_id)

#deg <- inner_join(deg,ids,by="probe_id")

deg <- merge(x = deg,y = ids2, by="probe_id")

deg <- deg[!duplicated(deg$symbol),]

dim(deg)

#2.加change列：上调或下调，火山图要用

#logFC_t=mean(deg$logFC)+2*sd(deg$logFC)

logFC_t=1.5

change=ifelse(deg$P.Value>0.05,'stable',

              ifelse( deg$logFC >logFC_t,'up',

                      ifelse( deg$logFC < -logFC_t,'down','stable') )

)

deg <- mutate(deg,change)

head(deg)

table(deg$change)

3.加ENTREZID列，后面富集分析要用

library(ggplot2)

library(clusterProfiler)

library(org.Hs.eg.db)

s2e <- bitr(unique(deg$symbol), fromType = "SYMBOL",

            toType = c( "ENTREZID"),

            OrgDb = org.Hs.eg.db)

head(s2e)

head(deg)

deg <- inner_join(deg,s2e,by=c("symbol"="SYMBOL"))

head(deg)

save(logFC_t,deg,file = "step4_output.Rdata")

数据可视化-----火山图、热图

rm(list = ls())

load("step1_output.Rdata")

load("step2_output.Rdata")

load("step4_output.Rdata")

library(dplyr)

1.火山图

dat <- mutate(deg,v=-log10(P.Value))

if(T){

  for_label <- dat%>%

    filter(symbol %in% c("RUNX2","FN1"))

}

if(F){

  for_label <- dat %>% head(10)

}

if(F) {

  x1 = dat %>%

    filter(change == "up") %>%

    head(3)

  x2 = dat %>%

    filter(change == "down") %>%

    head(3)

  for_label = rbind(x1,x2)

}

p <- ggplot(data = dat,

            aes(x = logFC,

                y = v)) +

  geom_point(alpha=0.4, size=3.5,

            aes(color=change)) +

  ylab("-log10(Pvalue)")+

  scale_color_manual(values=c("blue", "grey","red"))+

  geom_vline(xintercept=c(-logFC_t,logFC_t),lty=4,col="black",lwd=0.8) +

  geom_hline(yintercept = -log10(0.05),lty=4,col="black",lwd=0.8) +

  theme_bw()

p

volcano_plot <- p +

  geom_point(size = 3, shape = 1, data = for_label) +

  ggrepel::geom_label_repel(

    aes(label = symbol),

    data = for_label,

    color="black"

  )

volcano_plot

ggsave(plot = volcano_plot,filename = paste0(gse,"volcano.png"))

2.绘制热图

cg=names(tail(sort(apply(exp,1,sd)),1000))

n=exp[cg,]

annotation_col=data.frame(group=group_list)

rownames(annotation_col)=colnames(n)

library(pheatmap)

heatmap_plot <- pheatmap(n,

        show_colnames =F,

        show_rownames = F,

        annotation_col=annotation_col,

        scale = "row")

#保存结果

library(ggplot2)

png(file = paste0(gse,"heatmap.png"))

ggsave(plot = heatmap_plot,filename = paste0(gse,"heatmap.png"))

dev.off()

目前我们已经完成了GEO数据挖掘的基因差异分析及可视化部分，已经拿到了上调下调的显著差异表达基因，但是疾病的发生往往不单单受某个基因的影响，如果想继续了解疾病癌症的发生机制，还需要大家继续关注后续即将分享的“基因富集通路”方面教程。

请持续关注“GEO数据挖掘”系列文章，每周一个实用干货带您上手生信分析。