Integrative genomic analysis of gemcitabine resistance in pancreatic cancer by patient-derived xenograft models

通过患者源性异种移植模型对胰腺癌中吉西他滨耐药性的整合基因组学分析

发表期刊：Clin Cancer Res

发表日期：2021 Mar 5

影响因子：10.107

DOI:  10.1158/1078-0432.CCR-19-3975

一、研究背景

胰腺癌（PC）是最致命的癌症之一，5年总生存率低于9%。据预测，到2030年，它将成为癌症相关死亡的第二大常见原因。虽然许多新型疗法，如靶向药物和免疫疗法，未能使PC患者受益。现在，化疗药物gemcitabine（一种抑制DNA复制从而抑制肿瘤生长的脱氧胞苷类药物）仍然是PC患者最常见的选择，但其疗效有限。大多数治疗的患者在几周内对gemcitabine由最初的敏感变为耐药。

近来，应用患者源异种移植模型（PDXs），保留了原发肿瘤的遗传信息、病理特征和组织学结构，使其成为评价肿瘤异质性和演变的良好体内模型，研究药物反应比传统细胞系更可靠。

二、材料与方法  

1 数据来源

1）细胞系：人PC细胞系MIA PaCa-2、Panc-1和BxPC-3

2）临床PC标本来自于在北京协和医院接受手术的患者：共利用136例PC患者的组织建立PDX模型，其中66例成功；在这些PDX中，有63个来自7个原发肿瘤组织，其余3个来自转移组织

 2 分析流程

1）PDXs模型的生成：构建小鼠模型

2）观察gemcitabine对PDX模型的治疗情况：一组为gemcitabine组，另一组为对照组；根据TGI%（肿瘤生长抑制率）的值，将PDXs模型分为四组。TGI%>100、80~100、50~80和<50的模型分别分为 "敏感组"、"部分敏感组"、"部分耐药组 "和 "耐药组"。

3）免疫组织化学分析、原位杂交(ISH)

4）全外显子测序、RNA-seq、miRNA-seq

5）RNA-seq：DESeq2分析差异、GFOLD评分的绝对值>1.0的mRNAs被认为是治疗后显著变化、包STRINGdb构建PPI网络、包pathview进行富集分析。

6）miRNA-seq：DESeq2分析差异、GFOLD评分绝对值大于1.0的miRNAs被认为是治疗后显著变化、使用miRTarBase、miRWalk和TargetScan对miRNA靶基因进行预测、使用Cytoscape可视化miRNA调控网络。

7）DNA甲基化阵列和数据分析

三、结果展示

01 - PDXs的组织学和基因组特征分析

为了分析gemcitabine耐药的生物标志物和机制，作者建立了4个队列的PDX小鼠模型（图1A）。临床病理特征显示，大多数患者具有侵袭性表型。根据组织学特征，建立的PDXs表现出与原始肿瘤的高度相似性（图1B）。

为了进一步验证模型，5个PDX和匹配的原发性患者肿瘤通过检查WES数据中的体细胞突变热点进行遗传表征。在删除基于之前的研究映射到小鼠基因组的读数后，分析了原发性肿瘤和PDX组织之间的突变热点（图S1）。

图S1 PDX样本中发现的原发性肿瘤突变的一致性和百分比

根据28个测序的PDXs（66个PDXs中对gemcitabine治疗耐药或敏感的28个），通过分析PDXs的突变谱，证实这些模型可以重现PC的分子特征。大多数PDX样本藏有其他PC相关数据库中报道的高频突变基因，如KRAS和TP53（图1C）。28/28个PDX中KRAS发生突变，其中14个G12D突变，11个G12V，2个G12R，1个Q61L突变（图1D）。在21/28个PDX中检测到TP53突变（图1C）。在11/28例中，所有突变模型中都观察到了TP53P72R，有一个模型藏有多个TP53突变（图1E）。

还比较了PDX模型和另外两个来自TCGA和UTSW的临床队列中5个变化最大的信号通路的突变谱（图1F）。RAS和p53信号通路的突变率在三个数据集中都非常高，而Notch和TGF-β信号通路在PDXs和UTSW数据集之间的一致性比TCGA数据集高。

图1 PDXs的组织学和分子特征

02 - gemcitabine在PDX模型中的药效学实验

为了研究耐药性，对已建立的66个PDX用gemcitabine治疗3周。通过肿瘤生长抑制（TGI％）评估药物反应。如图2A所示，这些PDXs模型对gemcitabine的TGI%显示范围为-16.2～170.06，按TGI%分为敏感组(n=16)、部分敏感组(n=19)、部分耐药组(n=18)和耐药组(n=13)四组，这四组的TGI%中位数分别为120.71、92.44、67.35和36.23(图2B、2C)。

作者将敏感组和部分敏感组PDXs对应的患者整合为一组，即高TGI%组，将部分耐药组和耐药组对应的患者整合为另一组，即低TGI%组。Kaplan-Meier生存分析显示，高TGI%组和低TGI%组的中位总生存期差异有统计学意义（图2D）。临床病理因素分析显示，N分期差与低TGI%相关。此外，单变量和多变量分析表明，低TGI%是PC预后的独立危险因素。

图2 gemcitabine在PDX模型中的药效学

03 - PC中吉西他滨固有耐药的分子特征

为了明确耐药和敏感模型的分子特征，采用多组学技术研究敏感组（n=15）和耐药组（n=13）PDX组织的分子特征。WES分析显示，药物反应与KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4、LRP1B和KMT2C等高突变基因之间没有相关性（图S3）。

图S3 药物反应与高度突变基因之间的相关性分析

RNA分析发现109个差异表达基因，与敏感组相比，其中耐药组有62个mRNAs上调，47个mRNAs下调(图3A)。KEGG富集分析显示，ABC转运体、氨基酸和核苷酸糖代谢、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路是富集的前三位通路，随后，分析了文献支持的吉西他滨相关通路中DEmRNAs的富集情况，发现在耐药组中，p53信号通路的多个基因被下调，DNA修复通路相关基因被上调（图3B）。

miRNA分析通过比较耐药组和敏感组，发现29个差异表达的miRNAs，24个上调，5个下调（图3A）。然后，计算了DEmRNAs中DEmiRNAs与其靶基因之间的Spearman相关性，并选择相关对构建了一个以抗性为中心的miRNA相关调控网络（图3C）。在该网络中，miR-299-5p、miR-381-3p、miR-934、miR18a-5p、miR127-5p、miR-411-5p和SGK1、STC1是具有诸多相关性的枢纽节点。

图3 胰腺癌中吉西他滨内在耐药的分子特征

为了进一步探讨这些DEmRNAs的作用，检测了MIA PaCa-2、PANC-1和BxPC-3三个胰腺癌细胞系中62个上调基因在耐药相关网络中的基本表达水平。分别有43、48和53个基因在MIA PaCa-2、PANC-1和BxPC-3中具有较高的表达水平。然后用慢病毒系统将其敲除，并采用高含量筛选(HCS)检测其对PC细胞增殖和gemcitabine敏感性的影响。分别敲除30.2%(13/43)、35.4%(17/48)和35.8%(19/53)的基因可以显著抑制MIA PaCa-2、PANC-1和BxPC-3的增殖(图4A-C)。其中，敲除MRPS5和GSPT1可促进其他类型癌症的细胞增殖，在三种细胞系中均表现出抑制作用(图4D)。而敲除27.9%(12/43)、14.6%(7/48)和28.3%(15/53)的基因，分别能够显著提高MIA PaCa-2、PANC-1和BxPC-3对gemcitabine的敏感性(图4E-G)。在这些基因中，CD55和DHTKD1的敲除均能增加三种细胞系的化学敏感性（图4H）。

通过qRT-PCR验证了3个miRNAs在耐药组中上调（图4I）。其中，miR-135a-5p的表达最为丰富。Kaplan-Meier生存分析显示，高水平的miR-135a-5p显著表示总生存期差（图4J）。此外，高水平的miR-135a-5p也显著表明手术后接受gemcitabine治疗的亚组总体生存率差（图4K）。单变量和多变量分析显示，它是PC患者预后的独立危险因素。

图4 介导gemcitabine耐药的DEmRNAs的功能验证

04 - Gemcitabine治疗后改变的分子特征和途径

化疗过程中的分子改变可能是获得性化疗耐药的原因之一。为了探索吉西他滨治疗过程中PDXs的分子信号，比较了治疗前后每个样本的多组学数据。GFOLD被用来评估RNA和miRNA的变化，确定了156个DEmRNA在gemcitabine治疗后经常增加或减少（图5A）。这些基因富集在补体和凝血级联、p53信号通路和HIF-1信号通路（图5B）。为了发现这些基因之间的相互作用，基于STRING数据库构建了一个基因网络（图S5）。由GDF15、H2AFX、RRM2、CDKN1A、CDT1和HISTH3H组成的子网络在gemcitabine治疗后上调，可能通过调节DNA复制和DNA修复来介导药物反应（图5C）。这些结果表明，gemcitabine反应受药物治疗后DNA复制和DNA修复途径的失调影响。

图S5 吉西他滨前后PDXs DEmRNAs的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络

还对miRNA的表达进行了同样的分析（图5D）。一些差异表达的miRNA在耐药组和敏感组中的已知功能发生了相反方向的变化（图5D）。这可能是由于耐药组和敏感组的优势细胞群不同所致。通过KEGG分析，DEmiRNAs预测的靶基因富集在PI3K-Akt、p53、HIF-1和其他一些癌症相关的通路中（图5E）。作者重点关注PI3K-Akt、p53和HIF-1信号通路中的基因，构建DEmiRNA-EmRNA调控网络（图5F）。CDKN1A、RRM2、EGLN3和PDK1受各种miRNA调控，可能有助于获得性耐药。

为了识别差异甲基化位置（DMPs），计算了每个样品处理前后在同一探针处的差异β值。差异β值大于0.1意味着低甲基化，小于-0.1意味着低甲基化（图5G）。耐药组和敏感组有4个DMPs变化方向相反，敏感组有1个DMPs为低甲基化，其他DMPs为低甲基化（图5G）。对DMPs中的基因进行KEGG通路分析，发现与RNA和miRNA分析结果相似的信号通路富集（图5H），说明这些通路参与了获得性吉西他滨耐药。

图5  Gemcitabine治疗后改变的分子特征和途径

作者在PDX模型中测量了Collisson等人的基因标志（图6A）。根据治疗前的表达，71.4%PDXs属于经典亚型，28.6%PDXs属于准增生亚型（QM-PDA），没有外分泌样亚型（图6B）。Collisson等报道QM-PDA亚型比经典亚型对gemcitabine更敏感，但本研究发现不同亚型的PDX模型之间没有明显差异（图6B）。分析了治疗后的分子亚型，发现22/28个PDXs保持相同的亚型，6个PDXs在治疗后发生变化。4个PDXs从经典型变为QM-PDA型，1个从QM-PDA型变为经典型，1个从QM-PDA型变为外分泌型（图6B）。

然后，还测试了Bailey等人报道的基因标志（图6C）。PDXs中的亚型与gemcitabine反应也没有相关性（图6D）。治疗后，只有一个模型从胰腺祖细胞亚型改变为鳞状亚型，其他模型保持不变（图6D）。

Tiriac等人通过将PC机体转录谱与药理分型结果相关联，构建了一个gemcitabine-sensitivity signatures。把这个签名应用到PDXs的RNA-seq数据中（图6E）。结果显示，gemcitabine敏感组的敏感分数高于耐药组，但没有显著差异（图6F）。然而，gemcitabine治疗后，敏感评分显著降低（图6G），这与gemcitabine治疗后PDXs模型的耐药性增加是一致的。

图6 基于基因标志的PDX亚型及其与gemcitabine反应的相关性

四、结论

总之，作者建立了PC的PDX模型，再现了PC患者的分子特征。通过对gemcitabine治疗前后PDXs的多组学分析，系统性地看到了内在的和获得性的耐药性。这些结果为发现新型生物标志物和开发PC的组合治疗策略提供了重要的候选。