Stewart-Morgan KR, Reverón-Gómez N, Groth A. Transcription Restart Establishes Chromatin Accessibility after DNA Replication. Molecular Cell. 2019 Jul;75(2):284-297.e6. DOI: 10.1016/j.molcel.2019.04.033. PMID: 31126739.

2019年，哥本哈根大学学者Stewart-Morgan KR, Reverón-Gómez N发表了关于DNA复制后转录重建染色质开放区域的研究成果。作者用EdU（EdU为带有标记的dUTP，可以标记新生成的DNA链）对细胞进行不同时间的处理，流式筛选新复制的细胞，这样，作者得到DNA复制后不同时间段的细胞。把EdU处理10分钟为新生代细胞，EdU处理2小时为成熟细胞（也可称之为稳态细胞），还做了中间组，分别是EdU处理30分钟和EdU处理1小时。作者对这4组细胞进行了染色质开放区域的分析（ATAC-seq），结果显示，成熟细胞在基因promoter和基因间（enhancer）的染色质开放区域明显比新生代细胞多。且作者用用两种不同的转录抑制剂（分别抑制转录起始和转录延伸）抑制成熟细胞和新生代细胞的转录，并进行ATAC-seq，结果显示转录抑制后，染色质开放区域明显减少，因此作者提出转录起始和延伸恢复了稳态染色质开放性区域。

主要研究结果：

1、传代后新生代细胞的染色质开放区域比成熟细胞的少

    DNA复制过程中，与转录相关的 DNA结合蛋白会从DNA上游离，DNA进行复制，复制完成后，转录因子又会重新结合到DNA上，回复转录水平，这个过程需要多长时间？转录因子的结合顺序是怎样的？这是作者要讨论的主题（图1A）。作者为了区分复制与非复制细胞，利用5-乙炔基-20-脱氧尿苷（EdU）对DNA进行标记EdU为带有标记的dUTP，可以标记新生成的DNA链）（图1B）。通过EdU不同处理时间将细胞分为复制新生代细胞（EdU处理10分钟）和复制后成熟细胞（EdU处理2小时）。并且通过流式将带标记的细胞分选出来（图1C）。然后对新生代细胞、成熟期细胞、稳态细胞的三个重复样本进行ATAC-seq分析，用聚类分析（图1D）和主成分分析（图1E），ATAC-peak（图1F）分析比较组内和组间差异。

结果显示成熟期与稳定期比较相似，具有更多的开放区域。而子代细胞的染色质开放区域较少。

Figure 1. Repli-ATAC-seq Reveals the Nascent Chromatin Landscape and Tracks Its Maturation（ repli-ATAC-seq 揭示了新生染色质区域和它的成熟轨迹 ）

2、 转录因子不能与新生的染色质结合，导致转录沉默

    根据repli-ATAC-seq数据，比较子代细胞和成熟细胞分别在转录起始位点（TSS）（图2A、B）、增强子位置（图2C、D）附近的染色质开放区域。结果显示在成熟期细胞中，TSS区域和增强子位置有更强的repli-ATAC-seq富集信号，这表明在TSS区域和增强子位置中，成熟期比子代有更多的染色质开放区域。对两组细胞进行RNA聚合酶5号丝氨酸磷酸化（RNA polii S5phos）的CHIP-seq数据进行分析（图2E、F）,比较两组的转录活性。结果显示成熟期细胞具有更高的转录活性。

综合上述结果显示，转录因子与RNA聚合酶难以与新生的染色质结合，从而导致转录沉默。

Figure 2. Nascent Chromatin Is Transcription Factor Inaccessible and Transcriptionally Silenced（ 转录因子难接近新生染色质和转录沉默 ）

3、染色质的开放性在复制后得到不同程度的恢复

为了观察染色质开放区域在子代细胞不同生长时间的变化（图3A），比较子代细胞不同生长时间后（0分钟、30分钟、1小时、2小时）的repli-ATAC-seq数据，表明在30分钟后染色质开放区域开始开放（图3B）。而RNA polii S5phos的ChIP-seq数据表明转录程序在复制后30分钟内得到恢复，并在2小时后达到DNA复制前水平（图3C）。随着DNA复制后时间增加，全基因组（图3D）和特定区域（图3E）的TSS区域上富集信号逐渐增强。比较不同时间内repli-ATAC-seq富集峰能达到正常水平时的数量（图3F），结果表明在仅8%的染色质开放区域来自于R0(新生代细胞)，随着时间增加，越来越多的染色质开放区域得到恢复（图3G）。

综合上述结果显示，染色质开放程度在DNA复制后30分钟开始恢复，并在2小时后恢复到复制前的水平。

Figure 3. Chromatin Accessibility Is Differentially Restored Post-replication（ 染色质开放程度在复制后有差异地恢复 ）

4、染色质开放程度与启动子、增强子、CpG密度的相关性

比较不同时间的启动子和增强子区域的repli-ATAC-seq富集峰变化（图4A、B），发现启动子的开放性恢复模式（图4A）与整体富集峰（图3G）的分布模式相似。而只有2%的增强子在DNA复制完成时能达到最强的信号。因此作者对增强子的恢复模式进一步研究，将增强子分为三类：1调节基本细胞过程的管家型增强子；2特异调节ESC细胞相关基因的ESC增强子；3作用于高度活跃的细胞特异性调控区域的强增强子。并比较三种增强子在不同时间的比例发现（图4D、E），超级增强子在DNA复制后1小时内90%得到恢复，这可能与整体的转录水平相关。

染色质的开放程度与基因的CpG含量有关，作者比较不同恢复类型的ATAC-SEQ中的CpG密度，发现R0峰的CpG密度最高，这可能与基因沉默相关（图4F），同时R1峰和R2峰的在TSS区域的CpG密度比R0和R0.5的密度要高，这可能是随着染色质开放区域的增加，启动子附近的CpG岛有更多的转录因子结合上去。

Figure 4. Feature-Based Determinants of Accessible Chromatin Restoration（开放染色质恢复特征的决定因素 ）

5、细胞基础功能相关基因在早期已经完成转录

作者将repli-ATAC-seq富集峰分成三种模式：1立即恢复信号的立即峰；2缓慢恢复信号的缓慢峰；3瞬间恢复并在成熟期不表达的瞬时峰。结果显示立即峰与缓慢峰主要出现在R0期，瞬时峰在早期就表现出来（图5A）。而缓慢峰占总体比例为64%，瞬时峰占比例较少（图5B）。将每个富集峰出现的位置进行注释，立即和缓慢峰的大部分是基因间的，可能代表远端顺式调节元件。相反，大约75％的瞬时峰存在于基因体内，或者在内含子或外显子中（图5C）。立即和慢峰主要位于基因的5'末端，表明这些恢复类别中的大多数基因峰位于启动子区域，瞬时峰常见于3'末端（图5D）。

作者选取那些在3'末端含有瞬时峰表达的基因进行研究，发现这些基因的长度比平均值要长（图5E），并且相对表达量要高（图5F），以及有更多的转录强制标记H3K36me3富集（图5G）。对这些基因功能研究发现，这些基因与细胞周期、RNA转录加工途径相关。这表明细胞基础功能相关基因在早期就已经完成转录。

Figure 5. Opportunistic Binding Events in Gene Bodies in the Wake of DNA Replication（ DNA复制后基因体中的随机结合事件 ）

6、转录是染色质开放性修复的主要驱动因素

作者用来抑制转录起始的抑制剂雷公藤内酯和抑制转录延伸的DRB分别作用于子代细胞，研究转录对染色质开放性的影响（图6A）。对不同处理组的repli-ATAC-seq数据显示，子代细胞的TSS区域和增强子区域都缺乏开放性（图6B、C）。雷公藤内酯处理后的成熟期细胞的染色质开放性程度与子代细胞相似，表明转录起始可促进染色质的开放。主成分分析结果显示子代细胞与成熟期细胞形成两个不同的簇，雷公藤内酯处理的成熟期细胞也单独地形成一个簇（图6D）。这些数据表明转录是染色质开放性修复的主要驱动因素。

根据repli-ATAC-seq信号峰形成过程，把不同处理组按照立即峰、缓慢峰、瞬时峰分类（图6E）。结果显示雷公藤内酯处理的成熟期细胞的瞬时峰富集程度最高；在缓慢峰中所有子代细胞都不能恢复到成熟期细胞的富集程度；而在立即峰中，两种抑制剂都成熟期细胞影响较少。

这些分析表明，为了恢复染色质稳态可及性，大多数基因组区域都需要转录起始和延伸。

Figure 6. Transcription Resolves Anomalous Binding Events and Restores Chromatin Accessibility Post-replication （ 转录解决异常结合事件以及复制后染色质开放性恢复 ）

总结

作者分析repli-ATAC-seq和ChIP-seq数据，发现新生的染色质缺乏可接近的位点和RNA聚合酶II。在子传代的2小时内，RNA聚合酶占据和染色质开放状态重新建立。综上所述，转录起始和延伸恢复了稳态染色质开放性区域。

Figure 7. Transcription Re-establishes the Accessible Chromatin Landscape Post- DNA Replication（ DNA复制后转录重建染色质开放区域 ）

涉及分析方法以及数据结果

1、主要分析方法

·实验模型和主题细节

··mESC Cell Culture

··Drosophila S2 Cell Culture

··DNA Labeling

··Transcription Inhibition

·方法详细信息

··ATAC-seq and Repli-ATAC-seq

··Flow Cytometry

··ChIP-seq and ChOR-seq

··RNA Extraction, cDNA Synthesis, and Real-Time Quantitative PCR

··Data Sequencing and Processing

·求峰值

··Repli-ATAC-seq

··ChIP-seq and ChOR-seq

··Genome-wide Analyses

··Restoration Categories Classification and Analyses

··Genome and Data Annotation

（实验详细参数见文献）

2、 实验数据

部分数据来自公共数据库，自己测序了65个样本。

Expression (GSM590126) and H3K36me3 (GSM590119) ChIP-seq data were taken from Marks et al. (2012). 

MINCE-seq data (GSM1974517 ,GSM1974519 ,GSM1974529 ,GSM1974531) were taken from Ramachandran and Henikoff(2016).

All data generated in this study has been deposited at GEO accession GSE128643.

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参考：http://www.gzscbio.com/sci/detail/196.html