背景知识
1.HLA（human leukocyte antigen）：人类白细胞抗原，它是一组紧密连锁的基因群，可以控制细胞间相互识别、调节免疫应答。HLA的部分基因可以编码细胞表面抗原受体，成为自身细胞的"独特的信号"，可以作为免疫系统区分自身和异体物质的基础
2.Merkel细胞癌：皮肤Merkel细胞癌(Merkel cell carcinoma, MCC)是一种罕见的皮肤侵袭性恶性肿瘤，由Merkel cell polyomavirus (MCPyV，默克尔多元癌细胞病毒)病毒引起。常见于浅肤色的老年人，有局部复发和区域淋巴结转移的倾向
3.免疫检查点： 调节T细胞活化和增殖的主要分子。免疫检查点抑制剂在多种癌症中的成功应用以及MCC的免疫易感性再次为研发更有效的MCC治疗方案带来希望
4.CIs(immune checkpoint inhibitors)/ICB(immune checkpoint blockade): 免疫检查点抑制剂。
T淋巴细胞是抗肿瘤免疫应答中的主要效应细胞，通过识别肿瘤特异性抗原(比如致癌病毒、分化抗原，表观遗传调控分子, 以及致癌过程中产生的新抗原等)产生细胞毒性反应。正常状态下, T淋巴细胞通过表达一系列激活性(促进T细胞分化增殖)和抑制性(抑制T细胞分化增殖)受体来调控免疫平衡，既可以调控生理性免疫应答, 又不会过度激活免疫系统而造成机体自我损伤。
但是肿瘤微环境中，随着肿瘤抗原对T细胞的持续刺激, T细胞表面的一系列抑制性受体表达水平升高，同时配体在癌细胞或抗原呈递细胞表面表达水平增高，将抑制T细胞活化增殖并诱导T细胞凋亡，从而导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，造成免疫逃逸
5.肿瘤新生抗原负荷（tumor neoantigen burden， TNB）：癌细胞不断扩增分裂，会产生很多新的突变。新的突变有一部分会形成新生抗原，新生抗原可以激活免疫系统。因此肿瘤新生抗原负荷越高，对这个药物的反应性就有可能越大
研究背景
癌症免疫治疗在临床上前景巨大，但是目前有许多使用这种技术的患者后来出现复发的状况。
本文团队在研究Merkel细胞时发现，20%的患者对免疫治疗有初步反应，但后来存在复发的情况，预后不理想。为了提高预后，理解后期/获得性免疫治疗耐受性的机理是有必要的。利用细胞免疫治疗临床试验，可以表征T细胞《=》抗原的相互作用，进而了解复杂的肿瘤细胞-免疫细胞之间的关系，并且为避免肿瘤复发应采取何种免疫联合疗法提供帮助。
翻译理解
Results
8--Identification of and clinical course of second validation patient.（第二验证患者的鉴定和临床过程）
为了验证我们的发现，我们试图对另一名患者进行类似的分析，最好是使用限制不同I类HLA的mcpyv特异性T细胞治疗。在我们机构之前使用mcpyv特异性T细胞和ICIs治疗的所有患者中，我们发现了另外一名早期反应和晚期/获得性免疫治疗耐药的患者。
患者9245-3，为简单起见被称为验证患者，接受mcpyv特异性CD8+ T细胞和检查点抑制治疗，这次使用限制HLA-A2和avelumab(抗pd - l1)的T细胞作为检查点抑制(补充图10;NCT0258482) 14、15。该验证患者对联合免疫治疗有18个月的应答，在此期间，通过影像学和病理评估，他实现了完全消退。然而，在18个月的时间点，他在一个肿瘤部位复发，肿瘤被切除(治疗后+ 565天)。耐药肿瘤表达MCPyV T抗原，免疫组化检测pan-HLA-ABC(补充图10)。
10--scRNAseq of tumor revealed HLA-A transcriptional downregulation.（肿瘤scRNAseq显示HLA-A转录下调。）
对于验证患者，肿瘤组织仅从晚耐药/获得性耐药时间(+ 565天)开始以可行的冷冻形式存在。因此，使用10x基因组学5’平台的scRNAseq对该耐药肿瘤(n = 5397细胞)以及匹配的外周血(n = 5870细胞;天+ 559;图4f-h，补充图12)提供额外的比较组织。我们再次观察到靶向HLA (HLA- a;F i g。通过全外显子组测序确定的HLA-A DNA序列没有变化(补充表4)。从验证患者身上培养肿瘤的尝试在短期和长期培养均不成功，因此无法检测干扰素-γ和5-氮杂胞苷的可逆性。
Methods
12-- Transcriptome alignment, barcode assignment and UMI counting（转录组比对，条形码分配和UMI计数。）
患者2586-4(discovery) 利用Cell Ranger v2.0.0， 9245-3 (validation)利用Cell Ranger v2.1.0，进行sample demultiplexing, barcode processing and single-cell gene counting。
首先，利用mkfastq流程将原始的BCL文件转为fastq；然后，利用count流程整合了STAR将每个fastq与hg38和Merkel cell polyomavirus序列（HM011556.1）比对，比对后的reads根据cell barcode以及UMIs进行过滤，接着利用aggr流程将Tumor与PBMC样本整合，生成两个gene-barcode表达矩阵(tumor和PBMC的)，同时进行了测序深度的校正
13--Biostatistical analysis—data normalization and correction（生物统计分析-数据规范化与校正）
与Zheng等人一样进行UMI归一化处理。只有在至少一个细胞中检测到至少一个UMI计数的基因被保留用于分析。对每个单元格执行库大小归一化。UMI计数按每个细胞中的UMI总数进行缩放，并乘以细胞间UMI总数的中位数。然后将数据进行log2转换，并使用Seurat手册中描述的ScaleData R函数校正不需要的变化源(检测到的UMIs数量)。校正后的归一化基因条形码矩阵作为降维和聚类分析的输入，归一化基因细胞条形码矩阵用于MAST分析，如下所示。
14--Gene expression analysis: discovery patient tumor（基因表达分析:发现患者肿瘤）
经序列比对和筛选，共分析7431个肿瘤细胞(T细胞治疗前2243个，T细胞治疗后5188个)。采用经过校正的归一化基因条码矩阵进行主成分分析(PCA)和t分布随机近邻嵌入(tSNE)分析。首先，保留Seurat选择的前873个变量最多的基因(对数均值表达值大于0.0125，离散度(方差/均值)大于0.5)进行PCA分析。然后选择前10个主组件(pc)进行tSNE可视化。使用30的perplexity值执行了1000次tSNE迭代。根据已建立的MCC肿瘤标志物NCAM1、ENO2、CHGA、KRT20和TILs标记的表达进行细胞分类和聚类。在此之前共有1984个癌细胞，获得性耐药时间点的癌细胞为5131个。使用R包MAST50进行T细胞治疗前后肿瘤细胞的差异表达分析。将归一化的基因-细胞条码作为输入。该模型将细胞检出率(CDR)作为协变量，以校正可能影响细胞中检测到的基因数量的生物和技术干扰因素(例如，细胞大小和扩增偏倚)。基因的错误发现率(FDR)为5%，折叠改变为>1.3。
16--Gene expression analysis: validation patient.（基因表达分析:验证患者）
首先使用聚合校正归一化基因条码矩阵进行主成分分析和t分布随机近邻嵌入(tSNE)分析。Seurat筛选的前2450个最易变基因(对数均值表达值大于0.05，离散度(方差/均值)大于0.5)保留用于主成分分析。前10台pc用于tSNE可视化。使用困惑值为50的tSNE进行了1000次迭代。如前一节所述，单元格聚类是使用Seurat (FindClusters R函数)中实现的基于图的聚类方法进行的。使用邻域大小为20、分辨率为0.6的前10个pc，识别出19个不同的细胞集群。根据特异性标记的富集程度对簇进行标记。R代码附在补充数据4中，数据提交给NCBI GEO，附录118056
17--Treatment with hypomethylating agents.（低甲基化剂处理）
体外肿瘤在添加20%胎牛血清和pen/strep抗生素的RPMI中机械分离、过滤并培养48 h。将未处理的肿瘤与5氮杂胞苷(多伦多研究化学品，终浓度1 μM)或gammainterferon(终浓度1000 IU/mL)处理的肿瘤进行比较。用直接唑醇分离RNA并进行逆转录。使用RT2 SYBR主混合物和市售引物对指示基因(Qiagen)进行qPCR。每个条件重复3次，qPCR重复2次。
