上科大范国平教授团队RNA-BS揭示DNMT1在m5C修饰中的双重作用及其线粒体功能机制：Mol Cell

表观遗传调控，包括DNA甲基化、RNA修饰和染色质重塑等，在神经退行性疾病中起重要作用。DNA甲基转移酶1（DNMT1）是一种已知的DNA甲基转移酶，主要负责维持DNA甲基化。然而DNMT1在非分裂细胞中的功能尚不清楚。此外，DNMT1的RFTS（replication focus targeting sequence ）结构域突变（如A560V）与多种神经退行性疾病相关，但其分子机制尚未完全阐明。

近日，美国加州大学洛杉矶分校终身教授/上海科技大学免疫化学研究所特聘教授范国平课题组揭示了 DNMT1在调控DNA和RNA甲基化中的双重作用，特别是其通过RNA修饰调控线粒体功能的机制。研究发现，DNMT1能够与mRNA结合并促进其稳定性，并通过招募NSUN2蛋白来调节RNA的5-甲基胞嘧啶（m5C）甲基化。此外，研究还发现DNMT1的RFTS结构域突变（如A560V）会导致代谢基因的RNA甲基化和稳定性异常，进而引发线粒体功能障碍和神经退行性疾病。这些发现为理解DNMT1在神经系统疾病中的作用提供了新的视角，并为开发靶向RNA甲基化的治疗策略提供了理论基础。相关研究成果以《DNAmethyltransferase 1 modulates mitochondrial function through bridging m5CRNA methylation》为题发表于《Molecular Cell》期刊。

文章标题：DNAmethyltransferase 1 modulates mitochondrial function through bridging m5CRNA methylation

发表时间：2025-05-05

发表期刊：MolecularCell

影响因子：IF14.5/Q1

技术平台：RNA-BS-seq、RRBS、RNA-seq等

DNMT1是一种维持DNA甲基化的DNA甲基转移酶。其复制焦点靶向序列（RFTS）结构域中的点突变会导致晚发性神经退行性疾病，如常染色体显性小脑性共济失调-耳聋和嗜睡症（ADCA-DN）疾病。本研究首先验证了DNMT1具有结合mRNA转录本的功能，并通过招募NOP2/Sun RNA甲基转移酶2（NSUN2）来促进RNA m5C甲基化。同时，RNA m5C甲基化增强那些调节线粒体功能基因的RNA稳定性。当小鼠的DNMT1 RFTS结构域发生突变时，会引发异常的DNMT1-RNA相互作用，并显著提高部分代谢基因的m5C RNA甲基化和RNA稳定性。因此，代谢RNA转录本水平增加导致了累积性的氧化应激、线粒体功能障碍和神经症状。总体而言，本研究结果揭示了DNMT1在调节DNA和RNA甲基化中的双重作用，并进一步调节了线粒体功能，为DNMT1突变诱导的神经退行性疾病的发病机制提供了新见解。

图形摘要 

研究方法

1. 细胞培养和基因编辑

细胞培养：使用HeLa细胞、HEK293T细胞以及小鼠胚胎干细胞（ESCs），并在特定条件下培养。

基因编辑：通过CRISPR-Cas9技术构建了携带Dnmt1A560V突变的小鼠模型和细胞系。

2、动物模型和行为学测试

小鼠模型：构建Dnmt1A560V突变小鼠模型，用于研究DNMT1突变对神经系统的长期影响。

行为学测试：包括后肢抓握测试和旋转杆测试，评估小鼠的运动功能障碍。

3. RNA结合蛋白分析

增强型交联免疫沉淀测序（eCLIP-seq）：鉴定DNMT1结合的mRNA转录本（DNMT1-bound

mRNA transcripts，DBTs），发现DNMT1能够结合大量mRNA，并影响其稳定性。

4. RNA甲基化分析

RNA-BS-seq：分析RNA m5C甲基化水平，发现DNMT1能够通过招募NSUN2蛋白来调节RNA的m5C甲基化。

质谱分析（UHPLC-MRM-MS/MS）：定量分析RNA甲基化水平，验证DNMT1对m5C甲基化的调控作用。

5. 蛋白质互作分析

Co-IP：检测DNMT1与NSUN2互作，并通过质谱分析鉴定DNMT1的互作蛋白。

等温滴定量热法（ITC）：检测DNMT1与NSUN2之间的结合亲和力。

6. 基因表达和表观遗传分析

RNA-seq：分析基因表达变化，发现Dnmt1A560V突变导致代谢基因表达失调。

DNA甲基化测序（EM-seq和RRBS）：分析DNA甲基化水平，发现突变对DNA甲基化影响较小，但对RNA甲基化影响显著。

7. 单细胞分析

scRNA-seq和snRNA-seq：分析神经组织中不同细胞类型的基因表达变化，揭示了广泛的氧化应激反应。

8. 代谢和线粒体功能分析

细胞能量代谢分析：评估细胞的氧气消耗率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）。

线粒体DNA含量测定：通过qPCR分析线粒体DNA含量。

氧化应激和ATP含量分析：检测细胞中的氧化应激和ATP水平。

结果图形

（1）DNMT1直接与mRNA结合以增强其稳定性

DNMT1能够与mRNA结合，并通过增强RNA稳定性以调控基因表达。通过eCLIP-seq技术，研究者在HeLa细胞和HEK293T细胞中鉴定出大量DBTs，这些转录本主要分布在5’UTR区域。DNMT1的结合显著增强了这些mRNA的稳定性，且这种稳定性与RNA的细胞核质比和翻译效率相关。

图1：DNMT1与参与转录后调控的部分mRNA结合

（2）DNMT1通过招募NSUN2调控DBTs的m5C RNA甲基化

DNMT1能够通过招募NSUN2蛋白来调节RNA m5C甲基化。通过免疫共沉淀实验和质谱分析，研究者发现DNMT1与NSUN2之间存在直接相互作用，且这种相互作用部分依赖于RNA。RNA-BS-seq分析显示，DNMT1敲低（KD）的细胞中m5C水平显著降低，且这些位点与DBTs高度重叠。

图2：DNMT1对mRNA上m5C RNA甲基化的调控 (A) 鉴定DNMT1相互作用蛋白的FLAG免疫沉淀（IP）实验方案，随后进行质谱（MS）分析。 (B) 在IP-MS实验中，通过质谱检测到的DNMT1相互作用肽段与非特异性肽段（仅EGFP）的丰度差异。 (C) 在HeLa细胞中异位表达全长NSUN2和FLAG标签的DNMT1。随后使用抗FLAG抗体进行染色质裂解液的IP。然后用抗NSUN2和抗DNMT1抗体对IP蛋白进行免疫检测。 (D) DNMT1结构域和FLAG-DNMT1分离片段（F1–F4）的示意图。 (E) 共免疫沉淀检测FLAG-DNMT1分离片段（F1–F4）与NSUN2的相互作用。 (F) RNA-BS-seq热图显示在HeLa细胞中鉴定出的依赖DNMT1的m5C位点。 (G) DBTs与含有DNMT1依赖性m5C位点的基因之间的重叠。 (H) 由于DNMT1敲低（KD）处理而在HeLa细胞中稳定性发生变化的转录本的鉴定。 (I) DBTs与因DNMT1 KD而RNA稳定性降低的基因之间的重叠。 (J) 对照组（Ctrl）和DNMT1 KD HeLa细胞中DBTs（左侧）和非DBTs（右侧）的RNA稳定性条形图。 (K) 对照组（Ctrl）和DNMT1 KD HeLa细胞中所有DBTs的RNA稳定性总结。 (L) 对含有DNMT1依赖性m5C位点的DBTs进行GO分析。 (M) 基因组轨迹显示在对照组和DNMT1 KD HeLa细胞中Slam-seq信号在SPG7上的分布。

（3）Dnmt1A560V突变小鼠出现代谢和神经系统疾病

Dnmt1A560V突变小鼠表现出多种代谢和神经症状，包括体重下降、运动功能障碍和氧化应激增加。这些症状与线粒体功能障碍相关，且在突变小鼠的多个组织中观察到代谢基因的RNA甲基化和稳定性显著增加。

图3：Dnmt1A560V小鼠表现出代谢和神经紊乱 (A) Dnmt1结构域示意图及ADCA-DN A560V突变的位置。 (B) 部分纯合突变（Hom）小鼠表现出圆顶状头颅的脑积水（上）。整体大脑显示出扩大的大脑半球、受压的嗅球和下陷的大脑皮层（下）。 (C) 代表性大脑矢状面（上）和冠状面（下）切片显示，与野生型（WT）小鼠相比，Hom突变小鼠的侧脑室（LVs）极度扩张，且大脑皮层变薄。 (D) 本研究中鉴定出的WT、Het和Hom小鼠的总数和脑积水小鼠的数量。 (E-F) 雄性小鼠（每种基因型n=20）（E）和磁性小鼠（每种基因型n=20）（F）的生长曲线。 (G) 本研究中三种基因型的白内障发病率。 (H-I) 三种基因型小鼠的后肢抓握评分，雄性（H）和雌性（I）。 (J-K) 6个月大雄性（J）和雌性（K）小鼠的旋转杆性能测试。

（4）Dnmt1A560V突变显著增加代谢mRNA转录本水平

在Dnmt1A560V突变小鼠细胞中，代谢基因的mRNA转录本水平显著增加。这些转录本的增加与RNA m5C甲基化水平升高相关，表明DNMT1突变增强了RNA甲基化和稳定性。

图4：Dnmt1点突变导致部分代谢基因的转录去抑制 (A) hDNMT1蛋白对DNA的甲基转移酶活性的发光检测。 (B) 不同小鼠组织中基因体的平均甲基化水平。CB，小脑；Cor，皮层；M，月龄。 (C) 不同样本中高甲基化和低甲基化DMRs比例。 (D) 最接近DMRs基因与DBTs的重叠。 (E) 皮层中与DBT相关的DMRs数量的饼图。 (F) 皮层中与DBT相关的DMRs的甲基化差异（左）和相应的基因表达变化倍数（右）。 (G) 鉴定皮层中的差异表达基因（DEGs）。 (H) 所有与DBT相关的DEGs的相对表达（左）和皮层中相应TSS±2 kb区域的甲基化水平（右）。 (I) 对皮层中与DBT相关的DEGs的TSS±2kb区域中，纯合子（Hom）与野生型（WT）之间的DNA甲基化变化比例分析。

（5）稳定化的DNMT1结合mRNA参与线粒体调节

DNMT1结合的mRNA稳定性增加与线粒体功能调节密切相关。研究发现，这些mRNA的稳定性增加导致代谢基因表达水平升高，进而影响线粒体功能和氧化应激反应。

图5：与线粒体功能相关的DBTs的稳定性 (A) hDNMT1蛋白与RNA寡核苷酸R1结合的电泳迁移率变化分析（EMSA）。 (B) 与NSUN2和WT或突变型hDNMT1蛋白孵育的RNA寡核苷酸R1的单核苷酸中的RNA m5C含量。 (C) 小鼠皮层中DBTs的m5C位点的RNA甲基化水平热图。 (D) WT、杂合子（Het）和纯合子（Hom）神经前体细胞（NPCs）中DBTs的RNA稳定性。 (E–H) 不同组织和细胞中一致上调的DBTs热图。 (I-J) 纯合子Dnmt1A560V突变在皮层（I）和小脑（J）中诱导的指示基因特征变化基因集富集分析（GSEA）。

（6）失调的DNMT1结合mRNA导致线粒体功能障碍

Dnmt1A560V突变导致DNMT1结合的mRNA失调，进而引发线粒体功能障碍。研究发现，突变小鼠的线粒体呼吸功能下降，ATP合成减少，氧化应激增加，这些变化与代谢基因的RNA甲基化和稳定性异常相关。

图6：失调的DBTs导致线粒体功能障碍 (A) 热图显示不同组织和细胞中线粒体（mt）基因的倍数变化。 (B) 与线粒体功能相关的实验设计图。 (C-F) 条形图显示三种基因型成纤维细胞的线粒体呼吸（C）、ATP相关呼吸（D）、最大呼吸（E）和质子泄漏（F）。 (G-H) 三种基因型成纤维细胞的相对H2O2含量（G）和ATP含量（H）。 (I) 条形图显示成纤维细胞中线粒体DNA含量。 (J) 条形图显示三种基因型大脑皮层的线粒体复合体驱动的呼吸。 (K) 条形图显示大脑皮层的线粒体DNA含量。 (L) 12月龄小鼠禁食4小时后的血糖水平。

（7）单细胞分析揭示神经组织中广泛的氧化应激反应

通过单细胞RNA测序分析，研究发现Dnmt1A560V突变小鼠的神经组织中存在广泛的氧化应激反应。这些反应涉及多个细胞类型，包括少突胶质细胞和抑制性神经元，表明DNMT1突变对神经系统的广泛影响。

图7：单细胞分析揭示神经组织中广泛的氧化应激反应 (A) 单细胞文库制备示意图。 (B) 基于snRNA-seq的无偏倚UMAP可视化。 (C) 皮层中每个细胞亚型的标记物的点图。 (D) 细胞亚型中鉴定出的单细胞差异表达基因（scDEGs）数量及其与神经退行性相关基因的重叠条形图。 (E) scDEGs与神经退行性相关基因的重叠维恩图。 (F) 不同细胞亚型中Klf13b、Klf3a和Sqstm1表达的箱线图。 (G) 所有兴奋性神经元中鉴定出的scDEGs的GO分析。 (H) 基于UMAP可视化的视网膜中14669个细胞的9个聚类。 (I) 视网膜中scRNA-seq和bulk RNA-seq结果一致的差异表达基因（DEGs）的GO分析。在scRNA-seq和bulk RNA-seq中表现出一致变化趋势的DEGs被定义为一致DEGs。 (J) DNMT1调控的DBTs模型。突变导致DNMT1与RNA的相互作用增强，从而导致RNA过度抑制DNA甲基化（转录水平）和通过m5C RNA甲基化增强转录本稳定性。转录去抑制和DBTs的RNA甲基化共同驱动线粒体功能障碍，而ATP缺失和累积的氧化应激最终导致代谢和神经障碍。

易小结

本研究揭示了DNMT1在RNA修饰和线粒体功能调节中的新功能。DNMT1通过招募NSUN2调节RNA m5C甲基化，进而影响线粒体功能和神经退行性疾病发生。这些发现为开发靶向RNA甲基化的治疗策略提供了新的靶点，并为理解DNMT1在神经系统疾病中的作用提供了新视角。

RNA-BS-seq分析在本研究中的重要作用

RNA-BS-seq技术在本研究中发挥了关键作用。它不仅用于分析DNMT1和NSUN2在RNA甲基化中的作用，还揭示了Dnmt1A560V突变对RNA甲基化水平的影响。通过RNA-BS-seq，研究者能够单碱基分辨率检测RNA m5C甲基化水平，并鉴定出与DNMT1结合的mRNA转录本。这些数据为理解DNMT1在RNA修饰中的作用提供了重要依据。

参考文献：

Wanget al., DNA methyltransferase 1 modulates mitochondrial function throughbridging m5C RNA methylation,Molecular Cell (2025),https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.04.019