A mycoreovirussuppresses RNA silencing in the white root rot fungus, Rosellinia necatrix(Yaegashi etal., 2013)真菌病毒抑制白纹羽病菌的RNA沉默反应
摘要
RNA沉默是真菌防御病毒的机制，文章发现RnMyRV3真菌病毒可以抑制这个机制。作者构建了一个GFP表达载体，真菌RNA沉默会抑制其GFP基因表达，然后用几个候选病毒侵染真菌，观察病毒感染对真菌RNA沉默的影响。其中RnMyRV3病毒抑制了真菌基因沉默，降低了GFP-small interfering (si) RNAs的水平，增加了GFP-double-stranded(ds) RNA的积累。结果显示病毒干扰了dsRNA的切割过程（dicing）。植物农杆菌实验结果显示RnMyRV3的S10基因可以抑制RNA沉默。
综述
RNA沉默是寄主防御病毒的常用机制，真菌病毒很多家族都是dsRNA（Partitiviridae, the Totiviridae, theChrysoviridae和the Reoviridae），而一些ssRNA病毒的复制中间过程也会产生dsRNA（Hypoviridae, Narnaviridae, 和Endornaviridae）。
真菌寄主通过Dicer酶切割dsRNA→产生21-25nt的siRNA→siRNA与AGO（Argonaute）蛋白结合形成复合体RISC（RNA-induced silencing complex）→RISC会通过序列匹配，指导降解外源dsRNA（【现学现卖】综述-真菌与病毒的周旋）。
而病毒也衍生出了一系列对抗寄主RNA沉默的机制，一般，病毒编码的可以抑制RNA沉默的蛋白质统称为RSS（RNA silencing suppressor）。前期研究表明，Cryphonectriahypovirus 1 (CHV1)可以通过一种papain-likeprotease P29（RSS）抑制🌰疫病菌RNA沉默（【现学现卖】综述-真菌与病毒的周旋）。
实验操作（这个文章的准备材料很多，建议先看试验结果，再回来对应材料准备）
真菌材料：无毒野生型W97，通过皿内共培养菌丝融合实验成功接种不同的候选病毒。
构建载体：
用于转化真菌的载体：
（1）构建一个不含潮霉素抗性基因的GFP表达载体，pCPXHY1eGFP载体（含有GFP基因和潮霉素抗性基因）的双酶切（SalI 和 BamHI）片段（排除了潮霉素抗性基因只含有GFP基因），用T4DNA聚合酶试剂盒处理，质粒自连（self-ligated），产生pCPGFP载体。
（2）表达GFP基因发卡结构dsRNA的载体，首先中间隔离区域（spacer region，就是发卡里的圆形的部分）是400bp的GUS基因序列（nt 600-1000，β-葡糖苷酸酶基因，从pBI121质粒克隆，作为基因融合系统中的报告基因，广泛应用于细菌，植物，动物的基因调控、表达等研究），GUS用限制酶StuI和SphI连接在pCPXH1eGFP质粒的GFP序列下游，然后再GUS的下游连接一个反向的GFP，叫做pCPHdsGFP，示意图如下。
（3）构建含有dsGFP表达基因盒（cassette）载体，在pII99（含有geneticin抗性基因）基础上通过酶切加入pCPHdsGFP中的dsGFP基因盒，命名为pII99-dsGFP，示意图如下。
用于农杆菌渗入实验的载体：
前面研究发现RnMyRV3病毒可以抑制RNA沉默，所以想要分析其中12个可能的蛋白编码区域(S1: 29–4111 nt; S2: 63–3743 nt;S3: 463–3270 nt; S4: 29–2206 nt; S5: 46–1986 nt; S6: 105–2000 nt; S7: 20–1468nt; S8: 113–1090 nt; S9: 46–1188 nt; S10: 166–1098 nt; S11: 82–930 nt; S12:86–883 nt)，于是逆转录并用特异性引物扩增目的片段。扩增的cDNA片段连接在pGEM-T easy载体上，产生pGtiS1, pGtiS2, pGtiS3,pGtiS4, pGtiS5, pGtiS6, pGtiS7, pGtiS8, pGtiS9, pGPtiS10, pGtiS11, pGtiS12系列亚载体。
亚载体上的cDNA片段被扩增，然后连接在pBE2113 Ti质粒的35S启动子和nopalinesynthase终止子之间，产生系列Ti质粒，命名为pBE2113-S1, -S2, -S3, -S4, -S5, -S6, -S7, -S8, -S9, -S10,-S11, -S12。
为了在Ti中表达GFP，将pBI-GFP质粒中的GFP基因连接到pBE2113，产生pBE2113-mGFP质粒。
而质粒pBE2113-P35T（就是没有插入病毒cDNA的pBE2113 Ti质粒）和pBE2113-HCPro（含有cloveryellow vein virus的HCPro基因）作为阴性和阳性对照。
所有Ti质粒都分别转入了农杆菌C58C1菌株。
真菌的转化
通过PEG介导将pCPGFP载体转入W97菌株，产生表达荧光的菌株，RGFP菌株。想要诱导对GFP基因的沉默，可在RGFP菌株中转入pII99-dsGFP质粒，产生的具有geneticin抗性以及没有GFP荧光的菌株，叫做RiGFP菌株。而野生型W97菌株转入pII99-dsGFP质粒，产生的表达GFP的dsRNA的菌株，叫做irGFP菌株。
农杆菌渗入
用的是N. benthamiana line 16c烟草，农杆菌OD600=1.0。
以上，就是试验材料的准备工作，总算是介绍完了，看到这里可能根本记不住，没关系，可以在看试验结果的时候再回上文找这个试验用的材料的属性。
实验结果
诱导R. necatrix菌株RNA沉默
为了诱导真菌中GFP基因沉默，用真菌RGFP菌株（表达GFP）转化pII99-dsGFP质粒（表达dsGFP-RNA），得到RiGFP菌株。发现新产生的菌株不表达荧光（图3.A），且Northern blot（图3.B）RGFP中有GFP-mRNA积累，RiGFP中有GFP-siRNA积累。这些显示RiGFP不表达荧光是由于RNA沉默机制抑制了GFP的表达。
真菌病毒感染的菌株，其RNA沉默机制受抑制
将RiGFP与分别感染了4种病毒的野生型W97皿内共培养，使其菌丝融合，将病毒传到RiGFP菌株中。4种病毒传播成功（通过dsRNA提取验证的），但只在被发现在RnMyRV3病毒侵染的RiGFP菌株边缘检测到了荧光的表达，取这个发光部分重新培养，命名为RiGFP-reo菌株，该菌株比RGFP和RiGFP的生长速度都要慢。Northern blot结果显示RiGFP-reo中的GFP-siRNA的水平明显低于RiGFP，但是并没有完全消除。
RnMyRV3病毒干扰siRNA的产生
我们知道RiGFP-reo中仍能检测到GFP-siRNA，siRNA的产生可能是真菌RNA沉默导致的，或者在RdRp将ssRNA转化为dsRNA时也会产生一些siRNA（病毒复制）。那么RiGFP-reo的siRNA是由于病毒收到了部分抑制还是病毒复制时产生的呢？
为了了解，就做了下面的实验，irGFP菌株（正常表达GFP-dsRNA）与含有病毒的W97共培养，得到irGFP-reo。Northern blot分析结果表明与irGFP相比，病毒侵染菌株的GFP-siRNA表达水平降低了5倍以上。而dsRNA水平明显高于不含有病毒的。所以可以再一次说明，病毒干扰的是dsRNA剪切成siRNA的过程。
RnMyRV3病毒的S10基因抑制植物的RNA沉默
利用农杆菌侵染烟草的方法，试图找到编码RSS的基因。一共有12个候选基因，注射5后，只有包含S10基因的注射烟草叶片上可以观察到GFP荧光信号（还有HCPro也可以，是一个携带clover yellow vein virus的阳性对照）。同样也做了Northernblot检测siRNA和mRNA。
检测病毒的S10基因产物
S10基因（nt166-1098）预测可以编码34kDa的蛋白（310aa）。作者做了个免疫印迹实验，利用两种抗体（针对S10基因310aa的独立多肽序列，S10PN：51-69aa；S10PC：287-306aa）进行免疫印迹实验。
结果显示，S10PN抗体可以检测到约32和20KDa（P32和P20）的两种蛋白质，而S10PC抗体检测到P32和P11。推测P32是全长S10基因产物，而P20和P11为C端和N端截短的产物（而且是在烟草实验组才有，可能是烟草感染RnMyRV3后的特定产物）。
参考文献
Yaegashi, H.,Yoshikawa, N., Ito, T., and Kanematsu, S. (2013) A mycoreovirus suppresses RNAsilencing in the white root rot fungus, Rosellinia necatrix. Virology 444: 409-416.
