1. In VM, neutrophil recruitment and NET production peak during the acute phase

作者取了Sham, d4, d7, d14这几个时间点，发现外周血nets4天就已经很高了，到d14也仍存在。心脏nets的形成在d7的时候最多。

2. Early neutrophil depletion decreases cardiac monocyte recruitment and pro-inflammatory macrophage differentiation, improving VM-induced cardiac necrosis

随后作者使用Ly6G的抗体对中性粒细胞进行了清除
首先使用的是-1d, 1d和4d早期给抗体清除，在d7进行了检测。早期中性粒清楚之后，d7小鼠心脏的坏死(B)和炎症浸润(C)都出现了明显减轻。
随后作者使用流式检测了早期清除中性粒之后心脏血液骨髓的免疫细胞比例变化

⚠️⚠️流式panel（心脏、血液、骨髓）⚠️⚠️

D图显示清除中性粒之后，单核细胞比例下降，巨噬细胞比例变化不明显，和E, G的统计结果一致。F和H图展示了单核和巨噬细胞中促炎性Ly6C^high亚群的比例，结果显示巨噬细胞的促炎性亚群在早期清除中性粒之后出现了下降。
I-K图显示早期清除中性粒还显著降低了血浆多种趋化因子的水平。

3. Neutrophil depletion after the acute phase does not improve VM-induced cardiac necrosis

随后作者还在d7, d11给Ly6G抗体(晚期)清除中性粒，在d14进行检测。发现晚期清除中性粒没有改善小鼠心肌细胞坏死和炎症浸润，而且E图还显示，晚期清除中性粒之后，心脏单核细胞出现了增加。
These data indicate that detrimental chemotaxis between neutrophils and monocytes is temporally restricted to the early acute phase of the inflammatory response during VM.

4. Genetic NET ablation reduces inflammation during acute VM and cardiac macrophage presence

随后作者通过MRP8-Cre-ires/GFP x PAD4^fl/fl 构建了中性粒细胞特异性PAD4敲除鼠(PAD4 Ne-KO)。

MRP8-Cre-ires/GFP小鼠：

PAD4^fl/fl小鼠：
肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）在组蛋白H3中将精氨酸转化为瓜氨酸，促进瓜氨酸化组蛋白形成。NETs形成是PAD4依赖的，中性粒细胞能够表达高水平的 PAD4，通过瓜氨酸化调控途径启动 NETosis 及后续反应。抑制PAD4的活性可减少NETs形成。

中性粒细胞特异性NETs缺陷小鼠在造模后d7出现了心脏单核细胞的比例下降。中性粒细胞活化分子CXCL1，单核巨噬细胞活化分子CCL2 和 CXCL10在血浆中出现显著下降。

作者也在d14的时间点进行了检测，心脏坏死和炎症浸润都减轻，d14心脏巨噬细胞比例出现显著下降。

n summary, these results suggest that PAD4-dependent NETs are detrimental during the progression of CVB3-induced VM and that their presence is critical for monocyte/macrophage behaviour.

整体做的比较简单

关于Neu在VM中的作用，2018年的时候JMCC发表过这样一篇文章。

1. CVB3 is internalized by neutrophils

Fig 1A：作者首先分离了健康人外周血的中性粒，将1x10⁵中性粒加入了CVB3 (MOI of 1)刺激3h。然后吸掉有病毒的培养基，培养了1h和24h。免疫荧光结果显示1hpi和24hpi，细胞都检测出了VP1蛋白。（CVB3是用Vero细胞传代的，这里是做个阳参）
Fig 1B：为了我探究CVB3是和细胞膜结合还是被内化到胞内，作者使用流式检测了破膜和未破膜的中性粒。流式结果显示破膜后VP1+中性粒增加。提示CVB3 was mostly internalized by neutrophils。

2. CVB3 does not replicate in neutrophils

由于在人的中性粒中检测出了中性粒，作者进一步想要去探究CVB3是否会在中性粒中复制。
Fig 2A：作者检测了干预后不同时间点细胞内以及培养上清中的病毒滴度，发现随着培养时间延长，中性粒和中性粒培养上清中的中性粒都出现了下降。而Vero中则都出现上升。提示CVB3可以在Vero中复制，而不在CVB3中复制。
Fig 2B：semi-quantitative RT- PCR也是一样的结果（为了排除是中性粒半衰期短，随培养时间延长出现了死亡的情况）

3. CVB3 increases neutrophil binding to ECM and chemokine release

此前有报道显示一些病毒可以诱导多种中性粒细胞活化反应，包括CD11b的表达。而CD11b是中性粒-内皮互作的主要mediator。随后作者探究了CVB3感染对中性粒细胞CD11b表达的影响。
Fig 3A：结果显示1hpi时CD11b即出现了表达，而且呈剂量依赖性。
Fig 3B：CVB3感染后NEU与ECM蛋白的粘附能力也增加（CD11b的表达可以促进细胞与ECM的粘附）。

由于IL-8（CXCL8）是neutrophil extravasation的关键分析，作者对IL-8也进行了检测。
Fig 3C：结果显示CVB3刺激后，中性粒培养上清IL-8显著增加。
Fig 3D：CVB3干预后的培养上清对中性粒的趋化作用也增强。

4. CVB3 infection increases neutrophil survival

CVB3感染的中性粒凋亡减少，促炎因子分泌增加。

这么神奇吗

5. Neutrophils recognize viral infection through TLR-8

Because the antiviral response is mediated by endosomal TLRs, we first analyzed the effect of bafilomycin A1, an inhibitor of the vacuolar type H+ATPase, and found that CVB3-induced IL-6 release was suppressed in neutrophils pretreated with bafilomycin A1.
CVB3结合TLR3,7,8 (TLR9识别DNA)。TLR3在中性粒不表达，TLR7很少，TLR8比较多。TLR8的激动剂TL8-506可以诱导的IL6表达，TLR7的激动剂CL264则不行。但TLR7的激动剂CL264可以激活单核细胞IL6的表达。

6. CVB3 infection increases neutrophil strategies of pathogen elimination

CVB3感染促进了granular content release（MPO活性增强），ROS产生增加，TNF-a存在的条件下，给予CVB3，NETs产生也增加（有文献报道CVB3 infection markedly increased NET release in neutrophils that were previously primed by TNF-α）。

单独用CVB3刺激中性粒NETs不增加，有TNF存在的时候给CVB3才能刺激中性粒产生NETs。

给bafilomycin A1 (50 nM)则可以阻断TNF存在时CVB3刺激中性粒产生NETs。

有文献报道激活TLR8可以促进中性粒产生NETs

跟作者D图的结果一致。而且有TNF存在的时候给TLR8的激动剂中性粒产生NETs的能力比单给激动剂效果更好。

7. Role of neutrophils in CVB3-induced myocarditis

小鼠感染CVB3后2天，流式结果显示外周血中性粒没有检测出病毒。（所有白细胞都没检出病毒）由于流式检测效率低，精度也低，作者使用RT-PCR检测了小鼠外周血白细胞的病毒，发现Ly6G+ neutrophils 和 Ly6G- mononuclear cells中病毒都增加。

Neutrophil depletion mildly decreases viremia and heart viral titers

Neutrophil depletion decreases the severity of CVB3-induced myocarditis by reducing cardiomyocyte area, gene expression of CCL-2 and total inflammatory cell infiltration in the heart.